论文部分内容阅读
背景与目的乳头瘤病毒(human papilloma virus)为乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属,是一类特异感染人皮肤、粘膜的无包膜的小型双链环状DNA病毒,其分子量大约为8OO0bp。目前已分离出130多种,而其中约40型能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖,大多表现为寻常疣、尖锐湿疣等症状。随着尖锐湿疣、宫颈癌、肛门癌等发病率的逐年上升,人们对人乳头瘤病毒的关注度也越来越高。根据对组织的致癌性不同可分为低危型及高危型,高危型中HPV16、18型引起的宫颈癌最为常见,有研究资料显示,宫颈癌组织中约93%可检测到HPV DNA,其中HPV16型占65%[1]。HPVE6、E7是致癌关键蛋白。HPV 16E6是HPV感染过程中表达最早的蛋白之一,E6蛋白为一种多功能蛋白,其中E6可导致P53降解失活,使细胞周期失控[2];可作用于端粒酶、并激活,使正常细胞达到永生化[3];E6与含PDZ结构域的蛋白靶向结合,使得正常细胞发生癌变E6还可使促凋亡蛋白因子Bak的表达下调,增加染色体不稳定性,抗肿瘤细胞凋亡,可抑制TGF-R2的诱导和表达[4]。大量的来自动物及人体不同形式的HPV E6疫苗的研究证明E6蛋白具有免疫原性,其中含有许多病毒特异性CTL抗原表位[5]。由此产生的特异性CTL在消灭病毒感染细胞及相关肿瘤细胞的免疫反应中起重要作用,因此,利用E6作为靶抗原进行疫苗研究具有重要意义[6]。本实验在于了解大连地区宫颈癌患者HPV16型E6蛋白的结构特点,为临床诊断、治疗HPV16感染引起的疾病宫颈癌提供理论依据,为HPV致病性和抗原性的研究,以及为宫颈癌疫苗的研发提供参考。方法1通过常规方法提取组织DNA,分离出HPV16型DNA片段;2在有引物的参与中应用PCR技术扩增HPV16型E6基因片段;3目的基因片段(HPV16型E6蛋白)与pGM-T载体连接并转化至DH5α感受态细胞;4抽提质粒DNA,EcoRI酶切鉴定质粒DNA,阳性克隆质粒送测序;5以GenBank收录的日本HPV标准株E6序列为参考序列,用Blast及多序列比对软件Clustal X 2.1等对核苷酸序列和对应的氨基酸序列分析。结果1以宫颈癌组织标本(宫颈癌组织存于病理蜡块)中提取的DNA作为模板,PCR扩增,得到约为520bP的基因片段;2与pGM-T连接,构建HPV16型E6克隆质粒pGM-T-E6;3 EcoRI酶切鉴定质粒DNA正确;4克隆质粒测序发现六个样本均与日本HPV标准株E6序列(GenBank中序列编号分别为KJ543728.1及AB889490.1)高度同源,有3个患者HPVE6基因片段发生变异,变异位点为28(A-C)、54(G-T)、92(T-C)、138(T-G)。结论1成功克隆了HPV16型E6基因片段;2成功构建了HPVI6型E6蛋白原核表达系统;3大连市宫颈癌患者HPV16型E6基因与日本HPV标准株E6序列高度同源,并有部分碱基位点发生变异,为临床诊断、治疗HPV16感染引起宫颈癌提供理论依据,为HPV致病性和抗原性的研究,以及为宫颈癌疫苗的研发提供参考。