1.目的:观察参地颗粒对脾肾亏虚型慢性肾小球肾炎（Chronic Glomerulonephritis,CGN）患者的临床疗效;并探讨系膜增生性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis,Ms PGN）患者肾组织中PI3K-AKT-mTORC1信号通路对自噬的影响。2.方法:选取66例CGN脾肾亏虚证患者（预计60例,增加<15%的剔除和脱落病例数）作为研究对象,随机分为缬沙坦组、参地颗粒组、联合用药组,各22例。试验过程中共剔除6例,完成临床试验共60例,三组各20例。其中,缬沙坦组:予以缬沙坦80mg/日（晨服）;参地颗粒组给予参地颗粒,每日3次,一次1包,温水冲服;联合用药组给予参地颗粒,每日3次,一次1包,温水冲服,并同时予以缬沙坦80mg/日（晨服）;三组均进行12周治疗。观察三组患者治疗前后中医证候积分值,24h尿蛋白定量（24h Upro）、肾功能（Scr、BUN、e GFR）,同时对比三组患者的临床疾病疗效、中医证候疗效。此外,收集系膜增生性肾小球肾炎肾组织10例、正常人肾组织（左肾错构瘤大部分切术患者肾组织）1例,用于检测肾脏组织中PI3K、AKT、mTORC1、VDAC1、Beclin 1、LC3-Ⅱ及P62蛋白的表达情况,并采用透射电子显微镜观察肾组织中系膜细胞自噬体的数量及线粒体的形态变化。3.结果:3.1临床疾病疗效:缬沙坦组总有效率为60%、参地颗粒组为85%、联合用药组为95%,参地颗粒组与缬沙坦组比较有显著性差异（P<0.05）;缬沙坦组、联合用药组比较有显著性差异（P<0.05）;参地颗粒组与联合用药组比较未见显著性差异（P>0.05）。3.2中医证候疗效:缬沙坦总有效率为50%,参地颗粒组为90%、联合用药组为90%,参地颗粒组与缬沙坦组比较有显著性差异（P<0.05）;缬沙坦组、联合用药组比较有显著性差异（P<0.05）;参地颗粒组与联合用药组比较未见显著性差异（P>0.05）。3.3中医证候积分:治疗前三组无明显差异（P>0.05）;12周后,各组证候积分均有不同程度的下降（P<0.05）,其中参地颗粒组积分较缬沙坦组显著降低（P<0.05）,参地颗粒组与联合用药组间未见显著性差异（P>0.05）。3.4 24h Upro比较:与治疗前比较,第4周、第8周、第12周各组患者24h Upro比较差异均具有统计学意义（P<0.05）,且时间进程影响着治疗效果。治疗前、治疗第4周同时间点各组组间比较,患者24h Upro无统计学意义（P>0.05）;治疗第8周、第12周,同时间点均表现为缬沙坦组疗效低于参地颗粒组（P<0.05）,而以联合用药组疗效最优（P<0.05）。3.5肾功能:治疗前后,各组组间及组内比较均无显著性差异（P<0.05）,且肾功能指标（Scr、e GFR、BUN）均在正常范围内。3.6（1）肾组织中PI3K、AKT、mTORC1蛋白表达:与正常人肾组织相比,系膜增生性肾小球肾炎患者肾组织中PI3K、AKT、mTORC1表达水平均明显升高（P<0.05）;（2）肾组织中VDAC1、Beclin 1、LC3-Ⅱ及P62蛋白表达:与正常人肾组织相比,系膜增生性肾小球肾炎患者肾组织中VDAC1、Beclin 1、LC3-Ⅱ表达水平下降明显（P<0.05）,P62蛋白的表达水平则显著升高（P<0.05）。3.7肾组织中系膜细胞自噬体数量及线粒体形态观察:系膜增生性肾小球肾炎患者肾组织中系膜细胞自噬体数量相对正常肾组织中系膜细胞自噬体数量明显减少。系膜增生性肾小球肾炎患者肾组织中可见系膜细胞线粒体肿胀,宽大畸形,部分融合,线粒体嵴排列紊乱。3.8安全性指标:药物干预12周后,各组患者安全性指标无明显变化。4.结论:4.1参地颗粒可有效缓解CGN脾肾亏虚证患者的临床表现,消减尿蛋白,与缬沙坦联用有协同增效作用。4.2系膜增生性肾小球肾炎患者肾组织PI3K-AKT-mTORC1通路激活抑制了自噬活性。4.3系膜增生性肾小球肾炎患者肾组织存在系膜细胞线粒体功能障碍,自噬活性下降参与其中。4.4患者服用参地颗粒过程中未出现药物不良反应,说明该药安全性良好。1.目的基于PI3K-AKT-mTORC1信号通路研究参地颗粒对系膜增生性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis,Ms PGN）大鼠线粒体自噬的调节作用;并采用透射电子显微镜观察肾组织中系膜细胞线粒体的形态变化。2.方法选用2月龄雄性SPF级SD大鼠60只,体重200±50g,适应性饲养1周后以单纯随机抽样分为5组,各12只,包括假手术组,模型组,缬沙坦组,参地颗粒组,联合用药组。除假手术组外,其余48只大鼠经麻醉后切除左肾,术后2周采用单次尾静脉注射Thy-1抗体（333ug/只）,进行Ms PGN大鼠模型复制。并在注射抗体1周后检测大鼠尿蛋白,尿蛋白试纸结果为（+）⁺⁺,则动物模型复制成功。于注射抗体2周后开始灌胃,参地颗粒组给予相应剂量参地颗粒水溶液;缬沙坦组给予缬沙坦胶囊混悬液,联合用药组给予参地颗粒水溶液+缬沙坦胶囊混悬液;假手术组、模型组以生理盐水灌胃。每次4ml,每天1次,连续给药12周,代谢笼收集大鼠24h尿液,无菌采取腹主动脉血及右肾,检测血肌酐（serum Creatinine,Scr）、24小时尿蛋白定量（24-hoururine protein,24h Upro）;蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）、逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）法检测肾脏组织中PI3K、AKT、mTORC1、P62、VDAC1、Beclin 1、LC3-Ⅱ的表达水平;免疫荧光三染检测PI3K+AKT+mTORC1、VDAC1+P62+Beclin 1在肾组织中的表达情况（激光共聚焦显微镜扫描成像）;透射电子显微镜观察肾组织中系膜细胞自噬体的数量及线粒体的形态变化;苏木精-伊红（hematoxylin eosin,HE）、马松（MASSON）、过碘酸希夫（Periodic Acid-Schiff,PAS）染色观察各组大鼠肾组织病理改变。3.结果3.1假手术组大鼠反应灵敏,精神状态佳,毛发光泽稠密,饮食正常;其余各组造模后精神不振,毛发灰暗,易激惹,饮食较前减少,体重减轻。连续给药治疗12周后,大鼠精神状态及饮食量逐渐好转。其中参地颗粒组大鼠毛发光泽及饮食量优于缬沙坦组,联合用药组与参地颗粒大鼠状态无明显差异。3.2尿蛋白改变情况:与假手术组大鼠相比,各组大鼠24h Upro水平在造模后显著增加（P<0.05）。与模型组大鼠相比,缬沙坦组、参地颗粒组、联合用药组大鼠24h Upro水平显著降低（P<0.05）,参地颗粒组较缬沙坦组下降明显（P<0.05）,其中以联合用药组下降最为显著（P<0.05）。3.3 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTORC1/mTORC1表达情况（Western blot法）:（1）p-PI3K/PI3K:与假手术组比较,模型组与各药物治疗组p-PI3K/PI3K表达明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组p-PI3K/PI3K表达下降显著（P<0.05）;各治疗组之间对比无明显差异（P>0.05）。（2）p-AKT/AKT:与假手术组比较,模型组与各药物治疗组p-AKT/AKT表达明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组p-AKT/AKT表达下降显著（P<0.05）;各治疗组之间p-AKT/AKT表达对比有差异（P<0.05）,其中联合用药组下降最为显著（P<0.05）。（3）p-mTORC1/mTORC1:与假手术组比较,模型组与各药物治疗组p-mTORC1/mTORC1表达明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组p-mTORC1/mTORC1表达下降显著（P<0.05）;各治疗组之间对比无明显差异（P>0.05）。3.4 P62、Beclin 1、LC3-Ⅱ、VDAC1蛋白表达情况（Western blot法）:（1）P62:与假手术组比较,模型组与各药物治疗组P62蛋白表达量明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组P62蛋白表达量下降显著（P<0.05）;其中联合用药组最低（P<0.05）;缬沙坦组与参地颗粒组对比无明显差异（P>0.05）。（2）Beclin 1:与假手术组比较,模型组Beclin 1表达量明显降低（P<0.05）,各药物治疗组Beclin 1蛋白表达量明显上升（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组Beclin 1蛋白表达量明显上调（P<0.05）;其中联合用药组上调最为显著（P<0.05）。（3）LC3-Ⅱ:与假手术组比较,模型组LC3-Ⅱ表达量明显降低（P<0.05）,各药物治疗组LC3-Ⅱ蛋白表达量明显上升（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组Beclin 1蛋白表达量明显上调（P<0.05）;其中联合用药组上调最为显著（P<0.05）;与缬沙坦组对比,参地颗粒组上调显著（P<0.05）。（4）VDAC1:与假手术组比较,模型组VDAC1表达量明显降低（P<0.05）,各药物治疗组VDAC1蛋白表达量显著上调（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组VDAC1蛋白表达量明显上调（P<0.05）;其中联合用药组上调最为显著（P<0.05）;与缬沙坦组对比,参地颗粒组上调显著（P<0.05）。3.5肾组织中PI3K、AKT、mTORC1、VDAC1、Beclin 1及P62m RNA表达情况（RT-PCR）:（1）PI3Km RNA:与假手术组比较,模型组PI3Km RNA表达量明显升高（P<0.05）,各药物治疗组PI3Km RNA表达量无明显差异（P>0.05）;与模型组比较,各治疗组PI3Km RNA表达量显著下降（P<0.05）;各治疗组之间对比无明显差异（P>0.05）。（2）AKTm RNA:与假手术组比较,模型组与各药物治疗组AKTm RNA表达量明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组AKTm RNA表达量显著下降（P<0.05）;各治疗组之间对比无明显差异（P>0.05）。（3）mTORC1m RNA:与假手术组比较,模型组mTORC1m RNA表达量明显升高（P<0.05）,各药物治疗组mTORC1m RNA表达量无明显差异（P>0.05）;与模型组比较,各治疗组mTORC1m RNA表达量显著下降（P<0.05）;各治疗组之间对比无明显差异（P>0.05）。（4）VDAC1m RNA:与假手术组比较,模型组VDAC1m RNA表达量明显下降（P<0.05）,各药物治疗组VDAC1m RNA表达量明显上升（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组VDAC1m RNA表达量显著升高（P<0.05）;其中联合用药组上调最为显著（P<0.05）;缬沙坦组、参地颗粒组无显著差异（P<0.05）。（5）P62m RNA:与假手术组比较,模型组与各药物治疗组P62m RNA表达量明显上升（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组P62m RNA表达量明显下降（P<0.05）;其中联合用药组下调最为显著（P<0.05）;缬沙坦组、参地颗粒组无显著差异（P<0.05）。（6）Beclin 1m RNA:与假手术组比较,模型组Beclin 1m RNA表达量明显下降（P<0.05）,各药物治疗组Beclin 1m RNA表达量明显上升（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组Beclin 1m RNA表达量显著升高（P<0.05）;其中联合用药组上调最为显著（P<0.05）;缬沙坦组、参地颗粒组无显著差异（P<0.05）。3.6肾组织PI3K+AKT+mTORC1、VDAC1+P62+Beclin 1免疫荧光三染表达情况（1）PI3K+AKT+mTORC1:PI3K、AKT、mTORC1在假手术组均有表达,分别呈绿色、红色和橙色荧光;三者在模型组表达显著增强,呈明亮绿色、红色和橙色荧光;各药物干预组PI3K、AKT、mTORC1表达较模型组不同程度减弱,其中以联合用药组表达最弱。（2）VDAC1+P62+Beclin 1:P62在假手术组呈红色荧光,模型组及各药物干预组呈不同程度增强;VDAC1和Beclin 1在假手术组均有表达,分别呈明亮绿色与橙色荧光;二者在模型组表达显著减弱,呈橙色与红色荧光,各药物干预组VDAC1和Beclin 1表达较模型组不同程度增强,其中以联合用药组表达最显著,可见明亮绿色与橙色荧光。3.7电子显微镜检测肾组织中系膜细胞线粒体假手术组中线粒体形态正常,排列整齐;模型组中线粒体肿胀,宽大畸形,线粒体嵴排列紊乱。缬沙坦组线粒体排列较模型组整齐,可见线粒体空泡变性;参地颗粒组线粒体形态及排列较模型组明显改善;联合用药组仅少数线粒体肿胀,可见线粒体嵴且线粒体排列在治疗组中最为整齐。3.8实验大鼠肾脏病理观察假手术组肾小球结构正常,系膜细胞未见增生,细胞外基质未见明显增多,肾小球毛细血管腔形态正常,球囊未见狭窄及黏连。模型组肾组织系膜细胞与系膜基质弥漫性增生,毛细血管狭窄。与模型组相比,参地颗粒组、缬沙坦组、联合用药组病理损伤程度有所改善;参地颗粒组、氯沙坦组系膜细胞和系膜基质增生较模型组减轻,可见少量炎性细胞浸润。参地颗粒组系膜细胞与系膜基质增生程度较缬沙坦组轻。联合用药组中可见轻度系膜细胞集系膜基质增生。4.结论4.1参地颗粒可有效降低Ms PGN大鼠尿蛋白水平,与缬沙坦联合应用有协同增效作用。4.2参地颗粒可抑制Ms PGN大鼠肾组织PI3K-AKT-mTORC1活性,从而上调线粒体自噬水平。4.3参地颗粒可通过上调线粒体自噬活性,改善Ms PGN大鼠肾组织系膜细胞线粒体的功能障碍。4.4参地颗粒可减轻Ms PGN大鼠肾组织的病理损伤,而抑制Ms PGN大鼠肾组织PI3K-AKT-mTORC1活性,上调线粒体自噬水平,改善系膜细胞线粒体的功能障碍是其机制之一。