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背景系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)是不同程度的系膜区增宽、系膜细胞(glomerular mesangial cells, GMC)增生、系膜基质(extracellular matrix, ECM)增多为主要病理特征的肾小球疾病。我国原发性肾小球肾炎在肾小球病发生率为76.8%,其中MsPGN约占29.7%-59.5%,病情可逐渐进展至终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)。系膜细胞增生是其重要的病理变化,因此抑制系膜细胞增生是重要的治疗策略。三芪口服液是我科临床应用10多年取得良好疗效的药物,广泛用于治疗肾小球肾炎。针对其发挥疗效的作用机制进行深入探讨是对其进一步进行研发的基础,仅靠传统的研究方法是难以完成的,因此本研究拟通过基因表达谱芯片技术全面阐述三芪口服液的作用机制并为该药物的进一步研发奠定基础。目的一、了解我院系膜增生性肾小球肾炎患者的中医证候情况。二、应用基因芯片技术研究三芪口服液(Sanqi oral liquid, SQ)抑制LPS (lipopolysaccharide,脂多糖)诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的机制。方法一、采用回顾性研究方法,依据纳入、排除标准筛选我院2005年4月至2012年12月门诊及住院系膜增生性肾小球肾炎患者,分析符合纳入标准的患者的中医证候分布规律。二、三芪口服液对系膜增生性肾炎的机制研究1、通过三芪口服液对大鼠肾小球系膜细胞进行干预,应用MTT法检测系膜细胞的增殖情况,进而探讨三芪口服液对系膜细胞增殖的影响。2、应用三芪口服液大鼠肾小球系膜细胞进行干预,使用mRNA表达谱芯片检测不同浓度、不同作用时间条件下系膜细胞基因表达的变化情况。3、表达谱芯片的检测结果进行分析,应用聚类分析技术寻找三芪口服液作用前后基因变化的分类,进一步按照基因变化所属的pathway进行统计学富集分析,判断重要的机制,进而寻找三芪口服液的作用靶点。结果一、共纳入239例系膜增生性肾炎患者,通过对患者的中医证候分析,结果显示系膜增生性肾炎患者中医证型,本证主要为脾肾气虚、肺肾气虚、脾肾阳虚,标证主要为湿热证和血瘀证。二、在24h及48h培养时间下,LPS能刺激大鼠肾小球系膜细胞增殖,而三芪口服液后同培养48h时可抑制LPS对GMC的刺激性增殖作用,呈现浓度效应。二、芯片分析1、在芯片所探测的4172个基因所呈现的9种趋势中,有43个基因呈现了与细胞增殖实验相一致的趋势,这43个基因表达出多种分子功能,而较多地聚集在锌离子结合、ATP结合、蛋白结合、受体活性、丝氨酸抑肽酶活性、蛋白异源二聚化活性、细胞因子活性、微管活性、生长因子活性、激素受体活性、丝氨酸／苏氨酸激酶活性这11个分子功能上,通过聚类分析,基因的变化可归入TGF-β信号通路、轴突导向、细胞因子受体调节、类萜合成、类固醇合成、Hedgehog信号通路、ECM受体作用这7个通路上。2、差异表达的基因：LPS+1%SQ组与LPS刺激组相比,处理后的差异表达的基因有31095个,其中上调≥2倍的有12个,表达下调≥2倍的有2个；LPS+3%SQ组与LPS刺激组相比,处理后的差异表达的基因有31092个,其中上调≥2倍的有117个,表达下调≥2倍的有39个；LPS+5%SQ组与LPS刺激组相比,处理后的差异表达的基因有31096个,其中上调≥2倍的有232个,表达下调≥2倍的有185个。3、GO分析结果显示：在生物学过程的分类中关于细胞生理过程和代谢过程的基因居多,其中包括代谢相关基因、信号转导相关基因、细胞生长相关基因、细胞外基质和细胞骨架相关基因、细胞周期调节蛋白基因。以分子功能型的分类中,结合型基因居多。4、Pathway分析结果显示：有108条通路受到影响,其中显著影响的有11条,提示三芪口服液抑制LPS对系膜细胞的增殖的机制与多种物质代谢有关,包括亚麻酸、亚油酸、类固醇、甘油磷脂、嘌呤、维生素A等；其次,与细胞内多种信号通路有关,如Jak-STAT signaling pathway、MAPK signaling pathway、TGF-beta signaling pathway等,这些通路与细胞生长、分化和发育等关系密切,提示三芪口服液有可能通过上述通路发挥功能。结论1、239例我院2005年4月至2012年12月系膜增生性肾炎患者中,脾肾气虚及肺肾气虚等主证及由血瘀证所构成的标证的比例较大,三芪口服液组方符合中医证型分布。2、三芪口服液能够抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖,从而延缓大鼠肾小管间质纤维化进程。3、三芪口服液影响LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞的基因表达,主要通过调节与信号转导、细胞增殖、细胞凋亡、物质和能量代谢、细胞生长相关的基因,如BMP2、Pla2g2a、Pla2g4a、PAK1等,从多靶点发挥对系膜细胞生长的抑制作用。这些基因的作用需进一步验证。综上所述,基因芯片技术能够高通量筛选三芪口服液治疗的相关基因,并高效对基因功能进行研究,有助于筛选作用靶点。