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培育类胡萝卜素含量高的“黄金水稻”是有效解决人体维生素A缺乏的重要途径之一。玉米八氢番茄红素合成酶(ZmPSY)和八氢番茄红素脱氢酶(CRTI)是类胡萝卜素生物合成途径的两个关键酶,已被成功用于培育“黄金水稻”。近年研究发现,类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)对种子中类胡萝卜素的降解起重要作用。水稻中有6个CCD成员,其中只有OsCCD1在水稻胚乳中高表达,推测该基因对调节水稻胚乳中类胡萝卜素的累积起重要作用。此前,本项目合作单位香港中文大学谭保才教授课题组组构建了两个用于提高水稻种子类胡萝卜素含量的载体:pGYGC(简称为GC,其上的ZmPSY和CRTI基因分别由GluC启动子和Gtl启动子驱动)和pGTPCC(简称为PCC,在GC载体上连入“GluC-OsCCD1 RNAi”片段)。在此基础上,本课题将上述两个载体转入水稻中,探索通过降低OsCCD1的表达量,提高水稻种子中类胡萝卜素累积的效果,为培育下一代超级黄金水稻奠定基础。所取得的主要结果如下:1.水稻遗传转化。将PCC和GC两个载体转入水稻愈伤组织后,所产生的抗性愈伤组织分别呈橘黄色和亮黄色,而未转化的愈伤组织则为浅黄色。初步推测,PCC和GC所产生的抗性愈伤中的类胡萝卜素含量均明显提高;转PCC抗性愈伤比转GC抗性愈伤中的类胡萝卜素含量更高。将这些抗性愈伤分化后,分别获得38个和47个GC和PCC转基因株系。2.OsCCD1基因的表达分析。qRT-PCR分析表明,OsCCD1基因在PCC转基因水稻叶片组织中的表达量明显低于GC中的表达量,且两者的不同植株个体间OsCCD1基因的表达量亦存在差异。进一步推测,抑制OsCCD1基因的表达增加转PCC抗性愈伤组织和种子中类胡萝卜素量的积累,该基因的表达量差异导致其类胡萝卜素量积累差异。3.转基因水稻的表型特征。PCC和GC的转基因植株在水稻生长发育、种子形态上等与非转基因水稻无明显表型差异。然而,转PCC和GC水稻种子之间的胚乳颜色差异明显,与抗性愈伤组织的表型基本一致。其中,非转基因水稻的胚乳白色透亮,转GC种子的胚乳呈金黄色,而转PCC种子的胚乳呈深金黄色。表明非转基因水稻的胚乳中基本无类胡萝卜素积累,而转PCC种子中的类胡萝卜素积累量明显高于转GC水稻种子。4.水稻胚乳中类胡萝卜素含量测定。采用优化的HPLC分析方法测定类胡萝卜素含量。所测定的类胡萝卜素成分包括叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素,其中β-胡萝卜素为转基因水稻中类胡萝卜素的最主要成分。结果表明,在T1和T2代转基因水稻中,转PCC水稻种子的类胡萝卜素含量均明显高于转GC水稻种子。这些结果表明在提高类胡萝卜素生物合成量时,同时抑制OsCCD1基因表达,成熟水稻胚乳中的类胡萝卜素含量得到显著提高。这也证明了OsCCD1是一个在水稻种子类胡萝卜素分解代谢过程中起重要作用的基因。