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胃癌(Gastric cancer,GC)在全世界范围内都是一个发病率和致死率均较高的疾病，其中有接近一半的胃癌发生在中国。所以积极有效的治疗胃癌在我国是一个不容忽视的问题。关于胃癌的发病机制目前仍然不够清楚，目前关于胃癌的治疗手段主要包括内镜治疗、外科手术治疗、放化疗等。但是整体形势仍旧不容乐观，胃癌患者达到5年总生存率的仅有40%。所以我们急需要进一步明确胃癌的的发病机制和病理过程中的分子机制变化，才能够为治疗胃癌提供更加有效地治疗靶点。
第一部分 4.1B蛋白在胃癌患者胃粘膜的表达及与患者预后的关系
目的：
胃癌是一种世界范围内发病率和致死率均较高的疾病。在癌症相关死亡中居于第二位，在世界肿瘤发病率中居于第四位。目前许多研究表明4.1B蛋白在各种肿瘤中的表达出现减少或者缺失，关于4.1B在胃癌患者胃粘膜中的表达也有少量研究，但是这些研究还不够详细和深入。本部分研究首先拟观察胃癌患者胃粘膜组织中4.1B蛋白的表达水平与正常癌旁对照有何差异；然后进一步拟观察4.1B蛋白的表达水平能否作为一个独立因素影响胃癌患者的预后(DFS和OS)。
方法：
1.在郑州大学第五附属医院病理科选取2011年1月至2013年1月共计102例胃癌胃大切手术石蜡包埋标本。其中65岁以下49例，65岁以上53例。男性59例，女性43例。所有患者术前均未接受放化疗治疗。对应的癌旁对照组标本来自于距癌症部位至少大于5cm的正常胃粘膜，所有癌及癌旁正常胃粘膜均经HE染色及病理组织学诊断确诊。其中102例标本中，高分化病例仅有10例，中分化病例有34例，低分化或者未分化病例共计58例。本研究经郑州大学第五附属医院医学伦理委员会批准，患者或者家属均签署知情同意书。
2.苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色所有胃癌组织标本及正常癌旁对照组标本切片，拟观察组织细胞的结构。
结果：
1.根据IHC和表1的结果我们发现正常对照组胃粘膜4.1B蛋白的表达量明显高于胃癌患者胃粘膜细胞的表达量(x2=32.23；P＜0.001)，并且4.1B蛋白的表达水平与胃癌患者的病情轻重程度呈负相关。
2.表2结果显示4.1B的表达水平与肿瘤体积、肿瘤分化程度、淋巴结转移数量、整个TNM分级均呈负相关(P＜0.05)；而与患者的年龄、性别、幽门螺杆菌的感染、肿瘤的发生部位、WHO分级、血管侵袭、肿瘤侵袭的深度、神经转移等无明显相关性。
结论：
胃癌患者胃粘膜4.1B蛋白的表达水平与正常癌旁对照相比出现降低或者缺失，并且其表达水平与胃癌患者病情轻重程度呈负相关；4.1B蛋白的表达水平可以作为一个独立因素影响到胃癌患者的DFS和OS。
第二部分 4.1B蛋白在胃癌细胞中的表达及与细胞增殖的关系
目的：
此部分我们打算观察两种胃癌细胞株MGC-803和MKN-45中4.1B蛋白的表达水平，以及4.1B蛋白对两种胃癌细胞株增殖能力的影响。然后通过在胃癌细胞株MGC-803细胞内过表达4.1B蛋白和敲除MKN-45胃癌细胞株的4.1B基因，再观察对这两种胃癌细胞株的增殖能力有何影响。最后通过裸鼠皮下荷瘤实验观察4.1B蛋白的表达在体内对于胃癌细胞株增殖能力的影响。进一步通过检测EGFR/MAPK通路和PI3K/AKT通路信号蛋白的变化，了解4.1B蛋白影响胃癌细胞增殖的内部机制。
方法：
1.体外培养胃癌细胞株MGC-803和MKN-45，提取两种胃癌细胞株的总蛋白，然后通过western blotting技术检测两种胃癌细胞株4.1B蛋白的表达。
2.将胃癌细胞株MGC-803和MKN-45按照0.5×106/孔种植在10cm直径培养皿中，每组设置三个复孔。然后分别在第3天、第5天、第7天进行细胞计数，每组至少计数三次，取其平均值。最后用GraphPad Prism7以及SPSS20.0分析数据。
结果：
1.通过western blotting技术发现胃癌细胞株MGC-803的4.1B蛋白表达缺失，而胃癌细胞株MKN-45细胞4.1B蛋白表达呈阳性。
2.细胞增殖曲线发现4.1B蛋白表达阳性的MKN-45胃癌细胞株其细胞增殖能力较4.1B蛋白表达阴性的MGC-803细胞明显减慢，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
体内及体外实验显示4.1B蛋白能够通过EGFR/MAPK/ERK1/2以及EGFR/PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞的增殖。
第三部分 4.1B蛋白抑制肿瘤细胞增殖的机制
目的：
第一部分及第二部分的研究结果显示4.1B蛋白在胃癌患者和正常对照组胃粘膜细胞的表达存在差异；在增殖能力不同的胃癌细胞株MGC-803和MKN-45的表达量也有很大差异。并且我们通过裸鼠荷瘤实验也进一步验证4.1B蛋白的存在对胃癌细胞的增殖能力有一定的抑制作用，然后我们进一步通过western blotting结果发现4.1B蛋白对胃癌细胞的抑制作用是通过EGFR/MAPK/ERK1/2以及EGFR/PI3K/AKT通路实现的。但是我们发现4.1B蛋白的存在能够影响总的EGFR蛋白的水平，所以我们这一部分的目的是进一步探讨4.1B蛋白到底是如何影响到总的EGFR蛋白的水平的。
方法：
1.使用野生型的和4.1B基因敲除的C57BL/6小鼠模型，在母鼠怀孕第13.5天时处死小鼠，取出胚胎，分离出小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，体外处理使其永生化。然后观察野生型MEF细胞(4.1B+/+)和4.1B KO MEF细胞(4.1B-/-)的增殖情况，具体方法详见第二部分材料和方法。
2.提取野生型MEF细胞(4.1B+/+)和4.1B KO MEF细胞(4.1B-/-)的总蛋白，使用western blotting方法检测4.1B基因敲除前后EGFR/MAPK以及PI3K/AKT信号通路蛋白的变化。
结果：
1.4.1B KO MEF细胞(4.1B-/-)和野生型MEF细胞(4.1B+/+)相比，其增殖能力明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。
2.野生型MEF细胞(4.1B+/+)和4.1B KO MEF细胞(4.1B-/-)的western blotting结果与胃癌细胞株MGC-803和MKN-45相同，4.1B蛋白的变化也是通过影响EGFR/MAPK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT通路发挥作用的。
结论：
4.1B蛋白的FERM结构域通过与EGFR蛋白胞内近膜端起始13位氨基酸(P13)(R644-R656)相结合，进而抑制EGFR蛋白胞内近膜区(JM)的二聚化，抑制了EGFR的活化；EGFR活化减少通过下调MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT通路，进而下调了EGFR转录因子Sp1的活化，造成总的EGFR蛋白含量减少，总的EGFR蛋白的减少其磷酸化水平必然也降低，所以就形成一个负反馈进而影响到细胞的增殖。
第四部分 4.1B蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响及机制研究
目的：
前面三部分我们探讨了4.1B蛋白对胃癌细胞增殖的抑制作用及内部机制，这部分我们拟观察4.1B蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭的影响以及内部机制。
方法：
1.通过细胞粘附实验观察4.1B过表达组(4.1B-GFP)和对照组细胞(GFP-CON(4.1B-/-))的MGC-803细胞以及4.1B敲除组(4.1B KO)和对照组MKN-45(CON(4.1B+/+))的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化，胃癌细胞粘附速度的变化。利用全自动多功能酶标仪EnsightTM(Perkin EImer)在560nm处检测结晶紫吸光度。应用GraphPad Prism7以及SPSS20.0分析数据。
2.通过细胞铺展实验观察4.1B过表达组(4.1B-GFP)和对照组细胞(GFP-CON(4.1B-/-))的MGC-803细胞以及4.1B敲除组(4.1B KO)和对照组MKN-45(CON(4.1B+/+))的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化，胃癌细胞铺展速度的变化。
结果：
1.细胞粘附实验结果显示：4.1B过表达会增加胃癌细胞MGC-803细胞的粘附速度和延展面积。而敲除MKN-45细胞中的4.1B蛋白后，MKN-45(4.1B KO)的粘附速度和延展面积均较对照组MKN-45(CON(4.1B+/+))下降，差异有统计学意义。
2.细胞迁移和侵袭实验结果显示：4.1B蛋白过表达能抑制胃癌细胞MGC-803细胞的迁移和侵袭能力。而敲除MKN-45细胞中的4.1B蛋白后，MKN-45(4.1B KO)的迁移和侵袭能力较对照组MKN-45(CON(4.1B+/+))增加，差异有统计学意义。
结论：
4.1B蛋白通过抑制EGFR/MAPK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活来抑制EMT的进程，从而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。
第一部分 4.1B蛋白在胃癌患者胃粘膜的表达及与患者预后的关系
目的：
胃癌是一种世界范围内发病率和致死率均较高的疾病。在癌症相关死亡中居于第二位，在世界肿瘤发病率中居于第四位。目前许多研究表明4.1B蛋白在各种肿瘤中的表达出现减少或者缺失，关于4.1B在胃癌患者胃粘膜中的表达也有少量研究，但是这些研究还不够详细和深入。本部分研究首先拟观察胃癌患者胃粘膜组织中4.1B蛋白的表达水平与正常癌旁对照有何差异；然后进一步拟观察4.1B蛋白的表达水平能否作为一个独立因素影响胃癌患者的预后(DFS和OS)。
方法：
1.在郑州大学第五附属医院病理科选取2011年1月至2013年1月共计102例胃癌胃大切手术石蜡包埋标本。其中65岁以下49例，65岁以上53例。男性59例，女性43例。所有患者术前均未接受放化疗治疗。对应的癌旁对照组标本来自于距癌症部位至少大于5cm的正常胃粘膜，所有癌及癌旁正常胃粘膜均经HE染色及病理组织学诊断确诊。其中102例标本中，高分化病例仅有10例，中分化病例有34例，低分化或者未分化病例共计58例。本研究经郑州大学第五附属医院医学伦理委员会批准，患者或者家属均签署知情同意书。
2.苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色所有胃癌组织标本及正常癌旁对照组标本切片，拟观察组织细胞的结构。
结果：
1.根据IHC和表1的结果我们发现正常对照组胃粘膜4.1B蛋白的表达量明显高于胃癌患者胃粘膜细胞的表达量(x2=32.23；P＜0.001)，并且4.1B蛋白的表达水平与胃癌患者的病情轻重程度呈负相关。
2.表2结果显示4.1B的表达水平与肿瘤体积、肿瘤分化程度、淋巴结转移数量、整个TNM分级均呈负相关(P＜0.05)；而与患者的年龄、性别、幽门螺杆菌的感染、肿瘤的发生部位、WHO分级、血管侵袭、肿瘤侵袭的深度、神经转移等无明显相关性。
结论：
胃癌患者胃粘膜4.1B蛋白的表达水平与正常癌旁对照相比出现降低或者缺失，并且其表达水平与胃癌患者病情轻重程度呈负相关；4.1B蛋白的表达水平可以作为一个独立因素影响到胃癌患者的DFS和OS。
第二部分 4.1B蛋白在胃癌细胞中的表达及与细胞增殖的关系
目的：
此部分我们打算观察两种胃癌细胞株MGC-803和MKN-45中4.1B蛋白的表达水平，以及4.1B蛋白对两种胃癌细胞株增殖能力的影响。然后通过在胃癌细胞株MGC-803细胞内过表达4.1B蛋白和敲除MKN-45胃癌细胞株的4.1B基因，再观察对这两种胃癌细胞株的增殖能力有何影响。最后通过裸鼠皮下荷瘤实验观察4.1B蛋白的表达在体内对于胃癌细胞株增殖能力的影响。进一步通过检测EGFR/MAPK通路和PI3K/AKT通路信号蛋白的变化，了解4.1B蛋白影响胃癌细胞增殖的内部机制。
方法：
1.体外培养胃癌细胞株MGC-803和MKN-45，提取两种胃癌细胞株的总蛋白，然后通过western blotting技术检测两种胃癌细胞株4.1B蛋白的表达。
2.将胃癌细胞株MGC-803和MKN-45按照0.5×106/孔种植在10cm直径培养皿中，每组设置三个复孔。然后分别在第3天、第5天、第7天进行细胞计数，每组至少计数三次，取其平均值。最后用GraphPad Prism7以及SPSS20.0分析数据。
结果：
1.通过western blotting技术发现胃癌细胞株MGC-803的4.1B蛋白表达缺失，而胃癌细胞株MKN-45细胞4.1B蛋白表达呈阳性。
2.细胞增殖曲线发现4.1B蛋白表达阳性的MKN-45胃癌细胞株其细胞增殖能力较4.1B蛋白表达阴性的MGC-803细胞明显减慢，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
体内及体外实验显示4.1B蛋白能够通过EGFR/MAPK/ERK1/2以及EGFR/PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞的增殖。
第三部分 4.1B蛋白抑制肿瘤细胞增殖的机制
目的：
第一部分及第二部分的研究结果显示4.1B蛋白在胃癌患者和正常对照组胃粘膜细胞的表达存在差异；在增殖能力不同的胃癌细胞株MGC-803和MKN-45的表达量也有很大差异。并且我们通过裸鼠荷瘤实验也进一步验证4.1B蛋白的存在对胃癌细胞的增殖能力有一定的抑制作用，然后我们进一步通过western blotting结果发现4.1B蛋白对胃癌细胞的抑制作用是通过EGFR/MAPK/ERK1/2以及EGFR/PI3K/AKT通路实现的。但是我们发现4.1B蛋白的存在能够影响总的EGFR蛋白的水平，所以我们这一部分的目的是进一步探讨4.1B蛋白到底是如何影响到总的EGFR蛋白的水平的。
方法：
1.使用野生型的和4.1B基因敲除的C57BL/6小鼠模型，在母鼠怀孕第13.5天时处死小鼠，取出胚胎，分离出小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，体外处理使其永生化。然后观察野生型MEF细胞(4.1B+/+)和4.1B KO MEF细胞(4.1B-/-)的增殖情况，具体方法详见第二部分材料和方法。
2.提取野生型MEF细胞(4.1B+/+)和4.1B KO MEF细胞(4.1B-/-)的总蛋白，使用western blotting方法检测4.1B基因敲除前后EGFR/MAPK以及PI3K/AKT信号通路蛋白的变化。
结果：
1.4.1B KO MEF细胞(4.1B-/-)和野生型MEF细胞(4.1B+/+)相比，其增殖能力明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。
2.野生型MEF细胞(4.1B+/+)和4.1B KO MEF细胞(4.1B-/-)的western blotting结果与胃癌细胞株MGC-803和MKN-45相同，4.1B蛋白的变化也是通过影响EGFR/MAPK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT通路发挥作用的。
结论：
4.1B蛋白的FERM结构域通过与EGFR蛋白胞内近膜端起始13位氨基酸(P13)(R644-R656)相结合，进而抑制EGFR蛋白胞内近膜区(JM)的二聚化，抑制了EGFR的活化；EGFR活化减少通过下调MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT通路，进而下调了EGFR转录因子Sp1的活化，造成总的EGFR蛋白含量减少，总的EGFR蛋白的减少其磷酸化水平必然也降低，所以就形成一个负反馈进而影响到细胞的增殖。
第四部分 4.1B蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响及机制研究
目的：
前面三部分我们探讨了4.1B蛋白对胃癌细胞增殖的抑制作用及内部机制，这部分我们拟观察4.1B蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭的影响以及内部机制。
方法：
1.通过细胞粘附实验观察4.1B过表达组(4.1B-GFP)和对照组细胞(GFP-CON(4.1B-/-))的MGC-803细胞以及4.1B敲除组(4.1B KO)和对照组MKN-45(CON(4.1B+/+))的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化，胃癌细胞粘附速度的变化。利用全自动多功能酶标仪EnsightTM(Perkin EImer)在560nm处检测结晶紫吸光度。应用GraphPad Prism7以及SPSS20.0分析数据。
2.通过细胞铺展实验观察4.1B过表达组(4.1B-GFP)和对照组细胞(GFP-CON(4.1B-/-))的MGC-803细胞以及4.1B敲除组(4.1B KO)和对照组MKN-45(CON(4.1B+/+))的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化，胃癌细胞铺展速度的变化。
结果：
1.细胞粘附实验结果显示：4.1B过表达会增加胃癌细胞MGC-803细胞的粘附速度和延展面积。而敲除MKN-45细胞中的4.1B蛋白后，MKN-45(4.1B KO)的粘附速度和延展面积均较对照组MKN-45(CON(4.1B+/+))下降，差异有统计学意义。
2.细胞迁移和侵袭实验结果显示：4.1B蛋白过表达能抑制胃癌细胞MGC-803细胞的迁移和侵袭能力。而敲除MKN-45细胞中的4.1B蛋白后，MKN-45(4.1B KO)的迁移和侵袭能力较对照组MKN-45(CON(4.1B+/+))增加，差异有统计学意义。
结论：
4.1B蛋白通过抑制EGFR/MAPK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活来抑制EMT的进程，从而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。