第一部分小鼠JAZF1基因真核表达载体的构建及鉴定目的:构建小鼠JAZF1真核表达载体(pIRES2-EGFP-JAZF1)。方法:采用RT-PCR方法,从小鼠组织获得JAZF1 cDNA片断,经双酶切、连接重组至真核表达载体pIRES2-EGFP ,构建pIRES2-EGFP-JAZF1重组质粒。双酶切及DNA测序对该重组质粒进行鉴定。结果:将双酶切pIRES2-EGFP-JAZF1重组质粒和未作酶切的重组质粒一起经琼脂糖凝胶电泳,前者出现540bp(JAZF1cDNA产物)和约5.3kb(pIRES2-EGFP线性化质粒)两条带,后者出现约5.84kb左右的条带(pIRES2-EGFP-JAZF1重组质粒),初步鉴定重组质粒构建成功。测序结果经DNAssist对比分析,其核酸系列与Genbank中JAZF1 mRNA编码的BC048577CDS区的序列同源性完全相符,进一步证实所克隆的基因为小鼠JAZF1cDNA。结论:成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-JAZF1,可为研究未知功能基因JAZF1的生理功能及了解其在糖、脂代谢中的作用奠定坚实的基础。第二部分JAZF1基因mRNA在小鼠体内及3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中的表达目的:观察JAZF1基因mRNA在健康C57BL/6J小鼠体内及3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中的表达情况。方法:体外培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导分化,收集前脂肪细胞及诱导分化过程中4个不同时间点细胞,并同时将健康C57BL/6J雄性小鼠脱颈处死后取其多处组织如肝、心、脑、肺、脂肪、睾丸、胰、肌肉、肾,提取各组织及细胞中总RNA,逆转录合成cDNA,SYBER-GreenⅠ荧光染料实时荧光定量PCR检测各组织及不同时期细胞JAZF1表达情况,重复实验三次。结果:JAZF1在小鼠多处组织均有不同程度表达,其mRNA相对表达量从高至低依次为睾丸、脂肪、脑、肺、心脏、肝、胰、肌肉、肾脏;在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中JAZF1mRNA的表达量显著上调,除day5表达突然降低外。结论:JAZF1在维持正常生理功能调控中可能起着一定作用,并在脂肪组织、肝脏中表达量较高,因此可选脂肪细胞和肝细胞做为体外研究JAZF1功能的模型。此外,JAZF1参与了3T3-L1脂肪细胞的分化,可能参与了肥胖等代谢疾病的发生。第三部分JAZF1基因过表达对脂肪细胞、肝细胞糖脂代谢的影响目的:观察JAZF1基因(juxtaposed with another zinc finger gene 1)过表达对3T3-L1脂肪细胞、鼠肝细胞(IAR-20、Hepa1-6)糖脂代谢相关基因的影响。方法:将构建成功的JAZF1真核表达载体瞬时转染3T3-L1脂肪细胞、肝细胞(IAR-20、Hepa1-6),RT-QPCR法检测各细胞株转染实验组细胞中JAZF1、孤儿核受体TAK1、糖代谢相关基因(GLUT1、GLUT4)、脂代谢相关基因(FAS、ACC、SREBP1、ATGL、HSL、PPARα)以及细胞因子(FGF21)mRNA的表达;用Western blot测定各细胞JAZF1蛋白水平;油红O染色比色法检测3T3-L1脂肪细胞内脂质积累的变化;用2-Deoxy-[3H]-D-葡萄糖直接检测法观察3T3-L1各组脂肪细胞葡萄糖摄取量的变化。结果:转染48h后,各细胞株JAZF1转染组中,JAZF1mRNA表达及蛋白合成均明显高于阴性对照和空载组,HSLmRNA表达水平均明显增加(P<0.05),TAK1、FAS、ACC、SREBP1mRNA相对表达量均明显降低(均P<0.001),FGF21、visfatin、ATGL、GLUT1(除Hepa1-6、IAR-20)、GLUT4 mRNA表达均无明显改变(均P>0.05);此外,在Hepa1-6细胞中PPARα、GLUT1 mRNA表达增加(P<0.001);油红O染色、比色显示JAZF1转染组脂肪细胞内脂质积累明显降低(P<0.05);各组3T3-L1细胞非胰岛素介导及胰岛素介导的葡萄糖摄取率无显著性差异(均P>0.05)。结论:体外实验表明过表达JAZF1可减少脂质合成、增加脂解,并可明显改善脂质积累,其中Hepa1-6细胞实验表明JAZF1可能增加基础葡萄糖转运。JAZF1可能是肥胖和糖尿病治疗的一个潜在的新的靶点。