背景与目的胶质母细胞瘤（Glioblastomas,GBM）是人类致死率最高的癌症之一,即使经过包括手术和放化疗在内的各种积极的治疗后,也无法完全控制病情,且面临复发的风险。越来越多的证据表明,GBM是由具有干细胞特性的特定肿瘤细胞群来维持的,即胶质瘤干细胞（GSC）。GSC可表达干细胞标志物,且具有自我更新能力和多向分化的能力,有助于肿瘤的发生、治疗抵抗和复发,是GBM治疗的关键细胞靶点。然而,调节GSC增殖加剧和异常自我更新的分子机制仍未知。微小染色体维持蛋白（Mini chromosome maintenance MCM）在DNA复制许可中起着不可替代的作用,并与侵袭性人类恶性肿瘤有关。MCM功能的破坏导致基因组不稳定,从而生成癌细胞。MCM8的扩增和过表达已在多种人类癌症中被确定,其促进癌细胞的恶变和进展,这强调了MCM8在致癌过程中的重要性。一些MCM家族成员（如MCM2、MCM6和MCM7）与GBM的不良预后有关。然而,MCM8在GBM细胞和GSCs生物学中的作用目前尚未阐明。研究方法1.伦理审查本研究经中国医科大学附属第一医院伦理审查委员会批准。所有动物实验均获得中国医科大学动物伦理委员会的批准（批准文号:2017001M）。2.GSC分离培养将临床切除的胶质瘤标本分离成单个细胞,并在干细胞培养基中培养。3.实时荧光定量PCR通过试剂盒说明分离总RNA,进而逆转录成c DNA,然后使用SYBR进行定量PCR（q PCR）。每样品重复四次,β-肌动蛋白用作内参。4.蛋白质印迹先后进行蛋白质提取,BCA蛋白定量,蛋白质电泳,转印,封闭,一抗及二抗孵育,超敏ECL发光检测等步骤获得western blot条带,MCM8,EGFRv III,EGFR,CDC6,EZH2,CDCA2和ORC2等抗体被用作一抗。使用Image J等软件进行定量。5.慢病毒转染从Gene Chem获得用于MCM8沉默的两个独立的慢病毒sh RNA构建体。根据生产商的过表达方案,将cDNA克隆至基于慢病毒的载体中。6.细胞活力测定GSCs接种到96孔板中,定期使用细胞增殖测定试剂盒来检查细胞活力。7.Ed U染色细胞增殖试验单细胞被铺在24孔板上并培养过夜。第二天,将10μM的Ed U添加到培养基中并孵育1小时。而后使用试剂盒通过EDU染色观察增殖细胞。细胞核用Hoechst33342复染。8.流式细胞术将GSCs单细胞接种到六孔板中并培养24h。然后收获细胞,使用流式细胞仪定量细胞,通过Flow Jo V10软件进行分析。检测凋亡细胞。9.神经球形成实验分离的GSCs以一定个数铺于96孔板中。4天后检查神经球。对于辐射试验和替莫唑胺（TMZ）处理试验,用辐射或TMZ预处理等量的GSCs。五天后,计算每个样本中神经球的总数。10.颅内原位成瘤应用脑立体定位仪将转染的GSCs植入6周龄雌性BALB/c裸鼠的大脑,观察症状及记录生存期。一定时间后收集实验动物大脑进行HE染色,以分析肿瘤大小。11.谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉试验通过序列插入,转染,分离纯化,共孵育,离心洗脱等步骤后,使用抗His和抗GST通过免疫印迹分析蛋白。12.统计分析所有结果重复至少三次,且均为独立实验,最终呈现为多次实验平均值±平均值的标准误差（SEM）。采用卡方检验、t检验和方差分析确定统计学显著性。所有数据均呈正态分布,且方差相似。研究者对所有实验样本设盲。采用Pearson相关性检验基因表达水平之间的相关性。通过对数秩检验和Kaplan—Meier分析确定生存差异。P值＜0.05被视为具有统计学显著性。使用SPSS v.19.0软件进行统计分析。结果MCM8在GSCs中表达上调,控制GSCs的自我更新、体内致瘤性和治疗抵抗。MCM8的表达受表皮生长因子受体（EGFR）通路活性的调控。MCM8与DNA复制起始因子EZH2、CDC6和CDCA2相互作用,诱导这些因子与染色质结合。结论我们的研究揭示了由EGFR通路调节的MCM8通过与DNA复制起始因子相互作用维持GSCs的克隆形成和致瘤潜能,这可能为未来的研究提供新的治疗靶点。