水稻果胶甲基酯酶基因的克隆及表达研究

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果胶甲基酯酶(Pectin methylesterase,PME)普遍存在于植物细胞中,主要起内源调控植物细胞壁上以及细胞之间果胶含量的作用,并与植物根边缘细胞产生及释放有关。果胶甲基酯酶基因是一个基因家族,有些成员具有表达时空特异性。本研究通过克隆水稻果胶甲基酯酶基因,利用大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系进行PME蛋白的表达研究,并构建了不同的水稻果胶甲基酯酶基因表达载体,转化至水稻和拟南芥中,以探究果胶甲基酯酶基因表达与边缘细胞产生和释放的关系,以及对植物根尖抗逆境行为的影响。本研究的主要实验结果如下:(1)从水稻中克隆了与根边缘细胞释放相关的pme基因以及pme基因的抑制区(pectin methylesterase inhibitor,PI)、PME基因的功能区(pectin methylesterase doman,PD)、PME基因的反向序列(anti-pectinmethVlesterase,AP)。构建了四个植物表达载体:pCAMBIA13011-OS-pme,pCAMBIA13011-OS-Anti-pme,pCAMBIA13011-OS-pmeⅠ-Doman,pCAMBIA13011-OS-pme-Doman,通过农杆菌介导转化至水稻和拟南芥,得到转基因株系并得到验证。(2)利用大肠杆菌表达系统,构建大肠杆菌表达载体pET28a-OS-pme,导入大肠杆菌表达菌株BL21中,在IPTG诱导下表达PME蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达分子量及含量,结果表明大肠杆菌表达蛋白基本以包涵体形式存在,分子量约为68KDa,与预期大小相符,并以pET28a载体上的His·tag为抗体通过Western blotting鉴定证实。(3)利用毕赤酵母表达体系,构建酵母重组表达质粒pPIC9K-OS-pme。将重组质粒转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),在甲醇诱导下获得PME蛋白的分泌表达,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达分子量及含量,结果表明表达上清中有轻度糖基化的PME蛋白的分泌表达,分子量约为68KDa,与预期大小相符,并初步验证其活性。
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