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目的:设计构建针对p38丝裂原活化蛋白激酶( p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)基因的含有绿色荧光蛋白的小干扰RNA(small siRNA)表达载体,筛选出在脐静脉内皮细胞(HUVEC)中对p38MAPK表达的抑制作用最强的质粒,证实siRNA表达载体诱导的RNA干扰技术在HUVEC中沉默p38MAPK表达的可行性。方法:设计并将化学合成的寡聚核苷酸片断与线性化的pGensil-EGFP载体连接构建针对p38MAPKα基因的3个siRNA表达载体和一个阴性对照质粒;体外转染到HUVEC细胞株中,观察荧光蛋白的表达情况,并通过RT-PCR、western blot方法观察siRNA表达载体抑制P38MAPK靶基因、蛋白表达的情况。结果:成功构建了3个含有p38MAPK-siRNA的重组质粒(psi1、psi2、psi3)和一个阴性对照重组质粒psi4,将重组质粒转染到HUVEC中,24小时后观察荧光表达,当质粒与脂质体的质量比为1:2时,转染的效率最高达到48%以上;转染psi1、psi2和psi3的HUVEC细胞中p38MAPK mRNA、蛋白表达水平降低,与对照组相比,结果均具有显著性差异,以psi1的沉默效率最高,沉默效率达77%。结论:所构建的p38MAPK-siRNA表达质粒能有效地抑制HUVEC中p38MAPK基因的表达,以psi1质粒抑制效果最佳。目的:观察p38MAPKα干扰载体psi1沉默HUVEC内p38MAPK基因的表达情况及其与TLR4致糖尿病动脉粥样硬化的关系。方法:在体外模拟糖尿病状态,即高葡萄糖、糖基化终末产物(AGE)、高胰岛素及过氧化氢刺激HUVEC,应用RT-PCR、Western blot方法检测p38MAPKα干扰载体psi1对HUVEC p38MAPK的抑制作用;并通过免疫组化、RT-PCR、Western blot观察Toll样受体-4(toll-like receptor-4,TLR4)在刺激前后的表达变化。结果:高葡萄糖、糖基化终末产物(AGE)、高胰岛素及过氧化氢任何一种刺激引起的p38MAPK的增高都可被psi1抑制到正常水平;同时上述4种刺激因素会增加TLR4在HUVEC的表达,并被psi1抑制。结论:P38MAPKα干扰质粒psi1可有效抑制p38MAPK和TLR4的表达,为糖尿病动脉粥样硬化的基因治疗提供实验基础和理论依据。目的:构建含有组织特异性胎儿肉瘤样酪氨酸激酶-1(fms-like tyrosine kinase-1, FLT-1)启动子的真核表达载体,检测其转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后对荧光素酶报告基因表达的驱动能力,从而探讨应用FLT-1启动子实现组织特异性靶向基因治疗的可行性。方法:PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性;并予以高糖、高胰岛素、AGE、H2O2刺激HUVEC观察FLT-1mRNA表达水平及FLT-1启动子活性。结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc载体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,其在HUVEC细胞的荧光素酶活性明显高于HEK293细胞(p<0.01),而在HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达。高葡萄糖、糖基化终产物、高胰岛素和过氧化氢刺激后FLT-1mRNA表达明显增加,FLT-1启动子的转录活性也明显升高,最高达66%(以pGL3-promoter的启动子活性为100%)。结论:本研究克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,高糖、高胰岛素、AGE、H2O2刺激可增强其转录活性,故可作为动脉粥样硬化(AS)基因治疗的靶向血管内皮的启动子来源。