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艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的免疫缺陷性疾病。T淋巴细胞是机体免疫的指挥中枢,在抗HIV感染中起关键作用,可分为初始T细胞(naive T cells,Tn)和记忆T细胞(memory T cells,Tm),记忆T细胞依据表型不同,主要分为三个亚型:中央型(central memoryT cells,Tcm)和两个效应型(effector memory Tcells,Tem),包括CD45RA-CCR7-(Tem-1)及终末分化的CD45RA+CCR7-(Tem/td)。IL-7受体是维持T细胞稳态的主要因素,与IL-7结合后使促进T细胞生存的基因高表达,并增强抗凋亡分子生成,从而提高T细胞的存活能力。HIV感染可导致T细胞数量丢失和功能缺陷,而IL-7受体主要作用是促进T细胞的存活,那么IL-7受体数量和功能在HIV感染中的变化如何?前期对血浆IL-7水平研究发现,中国HIV感染者血浆IL-7水平升高,与疾病进展密切相关。本研究在此基础上,进一步研究了IL-7受体在中国HIV感染者不同亚群T细胞上的表达水平,探讨了其与血浆IL-7水平、各亚群T细胞内Bcl-2水平及疾病进展的相关性,现报道如下:
实验方法:
1、不同亚群T细胞表面IL-7受体(CD127)的检测应用以下FITC、PE、APC、PE-cy7、PerCP、APC-cy7标记单抗组合对HIV感染者和健康对照全血进行六色分析:CD4/CD127/CD45RA/CCR7/CD8/CD3,另设1管对照。加入100ul抗凝血,按上述组合依次加入单抗,室温避光30min。加入溶血素3毫升,室温,1200r/min离心5min,弃上清。加入3ml PBS悬浮,室温,1200r/min离心5min,弃上清,洗涤两次。加入1%多聚甲醛的PBS 200ul悬浮,BD FACSDiVa软件进行检测分析。Naive、MemoryT细胞判断标准如下: Naive T细胞: CD45RA+CCR7+ Memory T细胞:中央型:CD45RA-CCR7+ 效应型:Tem-1:CD45RA-CCR7- Tem/td:CD45RA+CCR7-
2、不同亚群T细胞内Bcl-2检测流式管中加入500ul全血及2ml BD溶血素,室温避光10分钟,离心弃上清,2ml PBS洗一次(500g,5分钟),弃上清。将CD4-FITC、CD8-PerCP、CD45RA-PE-cy7、CCR7-APC和CD3-APC-Cy7各10ul加入到流式管底部,另设1管不加抗体,室温避光15分钟,离心弃上清,2ml PBS洗一次(500g,5分钟),弃上清。应用BD细胞破膜固定试剂盒(BD cytofix/cytoperm kit),加入500ulFixation/Permeabilization solution,室温避光20分钟,离心弃上清,加入2ml BDPerm/Wash buffer,室温避光10分钟,离心弃上清,加入100ul BD Perm/Wash buffer重悬,加入Bcl-2-PE 10ul室温避光30分钟,2ml BD Perm/Wash buffer洗涤后弃上清,300ul PBS重悬,BD FACSDiVa软件进行检测。
3、血浆IL-7水平检测采用血浆标本,应用超敏感ELISA定量试剂盒(DIACLONE)依据说明书进行检测。
4、CD4+T细胞绝对值计数将20ul CD4/CD8/CD3啊TEST试剂加入绝对计数管中,加入50ul抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450ul,室温避光15min,FACS MULTISET软件检测并进行自动分析,计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。
5、统计学分析应用SPSS11.0软件包进行统计学分析。LTNP组、典型进展的HIV感染者组、典型进展的艾滋病人组、HAART治疗组及健康对照组各组间IL-7受体表达用方差分析进行比较,IL-7受体表达与CD4+T细胞数量、血浆IL-7水平和T细胞内Bcl-2水平之间相关性采用Spearman秩相关检验,P<0.05视为具有统计学意义。
结论:
(1)中国HIV/AIDS患者外周血T细胞上IL-7受体的表达明显低于健康对照,且随疾病进展下降更加明显,有效HAART治疗使T细胞上下降的IL-7受体趋于恢复。
(2)中国LTNP患者T细胞表面IL-7受体表达水平明显高于AIDS和HIV患者,与健康对照间差异不明显,提示高水平IL-7受体对疾病不进展有保护作用。
(3)中国HIV/AIDS患者T细胞表面IL-7受体表达水平与胞内Bcl-2表达之间呈明显的正相关,提示IL-7受体降低引起Bcl-2表达下降,进而导致T细胞存活能力降低。
(4)中国HIV/AIDS患者T细胞表面IL-7受体表达水平与血浆IL-7水平负相关,表明IL-7水平的升高可能是导致IL-7受体下降原因之一。