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目的:施万细胞脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)分泌不足是糖尿病周围神经病的发病机制之一。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可调节多种细胞功能,例如:增殖、自噬、迁移和凋亡等。然而mTOR通路是否参与了糖尿病周围神经施万细胞BDNF表达减少尚未见相关报道。DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferase 3a,DNMT 3a)是重要的表观遗传调节因子,其表达受mTOR通路调控。然而mTOR/DNMT 3a在糖尿病周围神经病变中是否也参与了对BDNF减少的调控目前还不清楚。因此本研究拟采用体外培养的大鼠施万细胞RSC 96,旨在探究mTOR/DNMT 3a对高糖诱导的施万细胞BDNF表达的影响。方法:1.Western blot、免疫荧光和qPCR检测高糖对RSC 96细胞mTOR、DNMT 3a和BDNF表达的影响将RSC 96细胞随机分为三组;正常糖组(normal glucose,N)、甘露醇组(D-mannitoll,M)和高糖组(high glucose,H),分别培养1天(1 d)、2天(2 d)和3天(3 d)。Western blot检测RSC 96细胞中phospho-mTOR(Ser2448)、mTOR、DNMT 3a和BDNF的蛋白表达;免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测RSC 96细胞的DNMT 3a和BDNF表达;qPCR检测BDNF m RNA表达。2.Western blot和qPCR检测高糖环境下抑制DNMT 3a对RSC 96细胞BDNF表达的影响在高糖环境下分别给予DNMTs抑制剂5-氮杂胞嘧啶(5-Azacytosine,5-Aza)刺激RSC 96细胞或给予靶向大鼠DNMT 3a基因的sh RNA质粒转染RSC 96细胞。Western blot检测DNMT 3a和BDNF的表达;qPCR检测BDNF m RNA含量。3.Western blot、免疫荧光和qPCR检测抑制mTOR通路对正常糖培养的RSC 96细胞DNMT 3a和BDNF表达的影响正常糖培养的RSC 96细胞给予mTOR通路抑制剂Torin 1,分别处理细胞0h、2h、4h、6h、12h和24h。Western blot检测phospho-mTOR(Ser2448)、mTOR、phospho-S6K 1(Thr 389)、S6K 1、phospho-4E-BP 1(Thr37/46)、4E-BP 1、DNMT 3a和BDNF的蛋白表达;IF检测DNMT 3a和BDNF的表达;qPCR检测BDNF的m RNA表达。4.Western blot、免疫荧光和qPCR检测激活mTOR通路对高糖诱导的RSC 96细胞DNMT 3a和BDNF表达的影响在高糖诱导的RSC 96细胞中分别给予mTOR通路激活剂MHY 1485处理细胞0h、2h、4h、6h、12h和24h。Western blot检测phospho-mTOR(Ser 2448)、mTOR、phospho-S6K 1(Thr 389)、S6K 1、phospho-4E-BP1(Thr 37/46)、4E-BP 1、DNMT 3a和BDNF的蛋白表达;IF检测DNMT 3a和BDNF表达;qPCR检测BDNF的m RNA表达。结果:1.高糖对RSC 96细胞mTOR、DNMT 3a和BDNF表达的影响Western blot结果显示;高糖组phospho-mTOR(Ser 2448)蛋白较甘露醇组在第2天和第3天均明显降低,分别下降了40.62%(P<0.05)和56.56%(P<0.01),总mTOR表达量在两组间未见显著差异。高糖显著上调了DNMT 3a的表达。Western blot结果显示;与甘露醇对照组比较,高糖组DMNT 3a蛋白在第2天和第3天分别增加了30.29%和39.33%(P<0.01)。IF结果显示;DNMT 3a主要定位于RSC 96细胞的细胞核中,与甘露醇组比较,高糖组DNMT 3a荧光强度明显增强。相反地,高糖下调了RSC 96细胞中BDNF的表达。Western blot结果提示;与甘露醇对照组比较,高糖组Pro-BDNF蛋白表达在第2天和第3天均明显降低,分别下降了12.83%和24.89%(P<0.05);mature BDNF蛋白表达在第2天和第3天均分别下降了25.9%和40.5%(P<0.05)。qPCR结果显示;高糖组BDNF m RNA与甘露醇组比在第二天减少了23.25%(P<0.01)。IF结果显示,BDNF主要定位于RSC 96细胞的胞浆和细胞核,高糖组BDNF荧光强度明显低于甘露醇对照组。2.抑制DNMT 3a对RSC 96细胞BDNF表达的影响高糖培养的RSC 96细胞给予5-Aza处理2天。Western blot结果显示;与DMSO组比较,5-Aza组的DNMT 3a下降了21.57%,Pro-BDNF和mature BDNF分别增加了22.94%和53.31%,差异有统计学意义(P<0.05)。qPCR结果显示;5-Aza组BDNF m RNA表达与DMSO组比升高了64.22%。同样地,采用靶向敲除DNMT 3a基因的sh RNA转染高糖培养的RSC96细胞,与空质粒对照组比较,DNMT 3a的蛋白表达下调了37.44%,Pro-BDNF和mature BDNF蛋白表达分别上调了30.42%和91.05%(P<0.05)。qPCR结果提示;转染DNMT 3a sh RNA组的BDNF m RNA表达与空质粒对照组比升高了33.08%。3.抑制mTOR通路对正常糖培养的RSC 96细胞DNMT 3a和BDNF表达的影响给予mTOR通路抑制剂Torin 1分别刺激正常培养的RSC 96细胞0h、2h、4h、6h、12h、24h。与正常糖0h比较,phospho-mTOR(Ser 2448)、phospho-S6K 1(Thr389)、phospho-4E-BP 1(Thr 37/46)均在2h明显下降,DNMT 3a在2h开始升高,BDNF在6h开始降低。Torin 1刺激24h的Western blot结果显示;与0h比较,DNMT 3a升高了2.01倍,Pro-BDNF降低了2.43倍;mature BDNF蛋白降低了2.97倍(P<0.01)。IF结果提示;Torin 1组与DMSO对照组比较DNMT 3a荧光强度增强,BDNF荧光强度减弱。qPCR结果显示;与DMSO组比较Torin 1组BDNF的m RNA降低了72.02%。4.激活mTOR通路对高糖诱导的RSC 96细胞DNMT 3a和BDNF表达的影响高糖培养的RSC 96细胞中给予mTOR通路激活剂MHY 1485分别刺激0h、2h、4h、6h、12h和24h。与高糖0h比较,phospho-mTOR(Ser2448)、phospho-S6K 1(Thr 389)、phospho-4E-BP 1(Thr 37/46)在4h上升明显,DNMT 3a在6h开始明显下降,BDNF在6h开始出现上升。Western blot结果提示;与高糖0h比较,给予MHY 1485刺激RSC 96细胞24h后,DNMT 3a降低了2.12倍,Pro-BDNF升高了2.31倍,mature BDNF升高了2.15倍。IF结果提示;给予MHY 1485组与DMSO对照组比较DNMT 3a荧光强度减弱,BDNF荧光强度增强。qPCR结果提示;与DMSO对照组比较,给予MHY 1485激活剂组BDNF的m RNA升高了1.21倍。结论:1.高糖诱导的RSC 96细胞phospho-mTOR(Ser 2448)表达降低,DNMT 3a表达升高,BDNF表达降低。2.下调RSC 96细胞DNMT 3a可升高BDNF表达。3.正常糖培养的RSC 96细胞,给予mTOR通路抑制剂Torin 1,DNMT3a表达升高,BDNF表达降低。4.高糖诱导的RSC 96细胞,给予mTOR通路激活剂MHY 1485,DNMT 3a表达降低,BDNF表达升高。