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目的：使用明胶-海藻酸钠（alginate-gelatin,Alg-Gel）体系构建用于生物三维打印的生物墨水，并向其中加入小鼠足底的脱细胞真皮匀浆（plantadermis,PD），形成类细胞外基质生物墨水。检测生物墨水的机械性能，并研究结构成分中加入PD之后，对于生物墨水的机械性能产生的影响。同时，使用浸提技术对生物墨水进行萃取，随后分别在萃取液和生物材料中对小鼠骨髓源间充质干细胞（Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BM-MSCs）进行培养，用普通培养基作为对照组，探讨不同构成生物墨水对MSCs增殖、迁移以及分化方面的影响。
方法：运用明胶-海藻酸钠体系，采用氯化钙作为交联剂构建生物墨水。按是否加入PD分为两组，检测生物墨水机械性能、流变曲线以及孔隙结构，比较PD对生物墨水物理特性的影响。
分离并培养小鼠MSCs，将其分为三组：第一组为F12标准培养基组，作为对照组；第二组为浸提液配制的F12培养基组；第三组为生物墨水组。对第一、二组培养的骨髓源间充质干细胞进行划痕实验，用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qPCR）检测三组细胞中整合素α5（Integrinalpha5,Itga5)和皮层肌动蛋白（Cortactin，Cttn）的表达情况。对三组细胞分别进行Ki-67免疫荧光染色，对阳性细胞进行计数，比较三组细胞增殖能力的差异。通过免疫荧光和qPCR对三组细胞的K8、K14、K18表达进行检测，比较三组细胞的分化能力。
采用qPCR法对细胞的YAP1表达情况进行检测，分析机械应力对于细胞内Hippo通路的激活情况及影响细胞生理活动的可能机制。
结果：（1）两组生物墨水的机械性能检测显示：加入PD的情况下，生物墨水的压缩模量为21.9±3.49KPa，拉伸模量为66.2±2.22KPa；而不加入PD时，生物墨水的压缩模量为20.4±3.75KPa，拉伸模量为22.4±8.32KPa。在电镜超微结构下，生物墨水呈现多孔状结构，加入PD后，生物墨水的孔隙结构更加规则完整。使用流变仪对加入PD前后的材料粘性以及稳定性检测。加入PD，生物墨水的粘性以及稳定性均在一定程度下有所提升。
（2）对于对照组以及萃取液组的细胞划痕实验结果显示：浸提液组的细胞迁移速度明显大于对照组，在同样条件培养相同时间的情况下，萃取液组划痕“愈合”速度、划痕内部细胞数量均高于对照组。三组细胞的qPCR结果显示，细胞黏附及迁移相关蛋白Itga5以及Cttn的表达在萃取液及生物墨水组中均有所升高（p＜0.05）。
（3）细胞Ki-67免疫荧光染色结果显示，在浸提液组中，Ki-67染色阳性细胞所占比例增加（p＜0.05），而对照组和生物墨水组免疫组化染色阳性的细胞所占比例没有明显差异。
（4）免疫荧光染色结果显示，对照组中上皮细胞标记物K14，以及汗腺细胞相关标记物K8和K18染色结果均为阴性。在浸提液组中，上皮细胞标记物K14染色结果为阳性，K8和K18阴性。而在生物墨水组中，细胞的K8、K14以及K18染色结果均为阳性。qPCR结果显示，在浸提液组中，K14相对表达量与对照组相比升高（p＜0.05），K8以及K18相对表达量均有略微升高（p＜0.05）。生物墨水组中，K8，K14以及K18相对表达量均有显著提高（p＜0.05）。
（5）对三组细胞的YAP1基因qPCR结果显示，对照组以及浸提液组中，YAP1基因的相对表达量无明显差异，而在生物墨水组中，YAP1的相对表达量明显提高（p＜0.05）。
结论：（1）生物墨水的机械性能检测结果显示，本实验所使用的生物墨水具有与小鼠真皮类似的机械强度，良好的可注射性及稳定性，能够运用于实验所述的3D打印细胞体外培养。在加入PD后，生物墨水的可延展性、孔隙结构的完整性、可注射性及稳定性均有不同程度的提升。
（2）在含有生物墨水化学成分的萃取液中培养细胞，细胞的迁移以及增殖能力均有提升。而在生物墨水中进行体外3D培养，细胞的增殖能力与浸提液组相比有所下降，考虑可能与打印过程中剪切力以及交联剂对细胞增殖的抑制作用相关。
（3）浸提液组细胞与对照组相比，骨髓来源间充质干细胞具有向上皮细胞方向分化潜能，但免疫荧光染色汗腺细胞相关标记物的表达呈阴性，生物墨水组中细胞则具有向汗腺细胞方向分化的潜能，汗腺相关标记物的表达呈阳性。
（4）生物墨水组中细胞YAP1相对表达量与其余组相比明显上升，作用机制可能与激活Hippo通路促进细胞分化相关。
方法：运用明胶-海藻酸钠体系，采用氯化钙作为交联剂构建生物墨水。按是否加入PD分为两组，检测生物墨水机械性能、流变曲线以及孔隙结构，比较PD对生物墨水物理特性的影响。
分离并培养小鼠MSCs，将其分为三组：第一组为F12标准培养基组，作为对照组；第二组为浸提液配制的F12培养基组；第三组为生物墨水组。对第一、二组培养的骨髓源间充质干细胞进行划痕实验，用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qPCR）检测三组细胞中整合素α5（Integrinalpha5,Itga5)和皮层肌动蛋白（Cortactin，Cttn）的表达情况。对三组细胞分别进行Ki-67免疫荧光染色，对阳性细胞进行计数，比较三组细胞增殖能力的差异。通过免疫荧光和qPCR对三组细胞的K8、K14、K18表达进行检测，比较三组细胞的分化能力。
采用qPCR法对细胞的YAP1表达情况进行检测，分析机械应力对于细胞内Hippo通路的激活情况及影响细胞生理活动的可能机制。
结果：（1）两组生物墨水的机械性能检测显示：加入PD的情况下，生物墨水的压缩模量为21.9±3.49KPa，拉伸模量为66.2±2.22KPa；而不加入PD时，生物墨水的压缩模量为20.4±3.75KPa，拉伸模量为22.4±8.32KPa。在电镜超微结构下，生物墨水呈现多孔状结构，加入PD后，生物墨水的孔隙结构更加规则完整。使用流变仪对加入PD前后的材料粘性以及稳定性检测。加入PD，生物墨水的粘性以及稳定性均在一定程度下有所提升。
（2）对于对照组以及萃取液组的细胞划痕实验结果显示：浸提液组的细胞迁移速度明显大于对照组，在同样条件培养相同时间的情况下，萃取液组划痕“愈合”速度、划痕内部细胞数量均高于对照组。三组细胞的qPCR结果显示，细胞黏附及迁移相关蛋白Itga5以及Cttn的表达在萃取液及生物墨水组中均有所升高（p＜0.05）。
（3）细胞Ki-67免疫荧光染色结果显示，在浸提液组中，Ki-67染色阳性细胞所占比例增加（p＜0.05），而对照组和生物墨水组免疫组化染色阳性的细胞所占比例没有明显差异。
（4）免疫荧光染色结果显示，对照组中上皮细胞标记物K14，以及汗腺细胞相关标记物K8和K18染色结果均为阴性。在浸提液组中，上皮细胞标记物K14染色结果为阳性，K8和K18阴性。而在生物墨水组中，细胞的K8、K14以及K18染色结果均为阳性。qPCR结果显示，在浸提液组中，K14相对表达量与对照组相比升高（p＜0.05），K8以及K18相对表达量均有略微升高（p＜0.05）。生物墨水组中，K8，K14以及K18相对表达量均有显著提高（p＜0.05）。
（5）对三组细胞的YAP1基因qPCR结果显示，对照组以及浸提液组中，YAP1基因的相对表达量无明显差异，而在生物墨水组中，YAP1的相对表达量明显提高（p＜0.05）。
结论：（1）生物墨水的机械性能检测结果显示，本实验所使用的生物墨水具有与小鼠真皮类似的机械强度，良好的可注射性及稳定性，能够运用于实验所述的3D打印细胞体外培养。在加入PD后，生物墨水的可延展性、孔隙结构的完整性、可注射性及稳定性均有不同程度的提升。
（2）在含有生物墨水化学成分的萃取液中培养细胞，细胞的迁移以及增殖能力均有提升。而在生物墨水中进行体外3D培养，细胞的增殖能力与浸提液组相比有所下降，考虑可能与打印过程中剪切力以及交联剂对细胞增殖的抑制作用相关。
（3）浸提液组细胞与对照组相比，骨髓来源间充质干细胞具有向上皮细胞方向分化潜能，但免疫荧光染色汗腺细胞相关标记物的表达呈阴性，生物墨水组中细胞则具有向汗腺细胞方向分化的潜能，汗腺相关标记物的表达呈阳性。
（4）生物墨水组中细胞YAP1相对表达量与其余组相比明显上升，作用机制可能与激活Hippo通路促进细胞分化相关。