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类固醇激素包括皮质激素和性类固醇激素,是脊椎动物重要的内分泌调节因子。cyp11a1编码的胆固醇侧链裂解酶催化所有类固醇激素共同前体孕烯醇酮的合成,对脊椎动物类固醇激素的合成至关重要。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的基因组序列已经公开,具有单性鱼苗,个体较大,便于取血,且能通过基因编辑进行缺失功能研究,是研究鱼类内分泌的良好模型。本研究分离了尼罗罗非鱼及其它脊椎动物的cyp11a1基因,分析了cyp11a1在尼罗罗非鱼成鱼各组织及性腺发育各时期的表达模式和细胞类型,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立罗非鱼cyp11a1突变系,并借助cyp11a1突变模型对皮质激素和性类固醇激素在罗非鱼个体存活和性别分化及配子发生中的作用进行了探讨。具体研究结果如下:1)尼罗罗非鱼及其它脊椎动物cyp11a1基因的分离。从尼罗罗非鱼基因组中分离了cyp11a1基因,并以罗非鱼cyp11a1的ORF序列为检索序列,通过blastn从NCBI中分离了人、鸡、中华软骨龟、爪蟾、腔棘鱼、斑点雀鳝、东方鲀、青鳉和斑马鱼等脊椎动物的cyp11a1基因。结果表明,除斑马鱼外,其它脊椎动物均只有1个cyp11a1基因。共线性分析表明,斑马鱼的2个cyp11a基因产生于串接复制而非真骨鱼特有的全基因组复制。2)cyp11a1在尼罗罗非鱼中的表达。转录组分析及Real-time PCR结果显示cyp11a1主要在成体尼罗罗非鱼精巢、卵巢和头肾组织表达。cyp11a1在孵化后5、7、20、30、40天卵巢的表达水平高于精巢,而在孵化后90、180和300天精巢的表达水平高于卵巢。原位杂交结果显示cyp11a1表达于尼罗罗非鱼精巢Leydig细胞、卵巢鞘膜细胞和间质细胞以及头肾肾间细胞中。3)尼罗罗非鱼cyp11a1纯合突变系的建立。通过CRISPR/Cas9成功突变罗非鱼cyp11a1并建立纯合突变系。分析发现,cyp11a1纯合突变鱼血清皮质醇含量显著降低,胆固醇含量显著升高。Real-time PCR结果显示,突变鱼垂体中促肾上腺皮质激素合成酶基因pomca的表达显著升高。突变鱼的头肾明显大于对照鱼头肾,且头肾肾间细胞胞质增生。这些结果表明,cyp11a1突变鱼头肾无法正常合成皮质醇。此外,分析发现纯合突变鱼可以存活但抗低氧能力显著下降。这些结果表明,皮质激素对于罗非鱼的压力应激很重要但对于存活不是必需的。4)cyp11a1纯合突变鱼性腺表型及基因表达分析。采用组织学检测孵化后90天、180天cyp11a1突变XX罗非鱼性腺发现,突变鱼性腺表现为精巢样结构,存在生精细胞。表明cyp11a1突变导致XX罗非鱼发生了由雌向雄的性逆转。对孵化后30天的XX突变鱼性腺进行分析发现,性腺中存在退化的卵母细胞,这表明生殖细胞早期仍然发育为卵母细胞,但无法维持。Real-time PCR结果表明,在孵化后90天突变XX鱼性腺中,雌性特异表达基因foxl2和雌激素合成酶基因cyp19a1a的表达显著降低,雄性特异表达基因dmrt1和雄激素合成酶基因cyp11c1的表达显著升高。与此一致的是,与对照雌鱼相比,突变鱼血清中E2水平显著降低。添加外源E2可以回救XX突变鱼的性逆转表型,回救的XX突变鱼性腺发育为卵巢,表明雌激素对于罗非鱼雌鱼卵巢分化至关重要。对孵化后90天和180天cyp11a1突变XY雄鱼进行分析发现,突变鱼血清11-KT和T的水平极低,突变鱼性腺具有精巢形态,但精子发生几乎无法进行。添加cyp11a1直接下游产物孕烯醇酮可以升高突变鱼血清中11-KT和T的水平,精子发生恢复。值得注意的是,无论是在cyp11a1突变XX鱼还是在突变XY鱼中,仍会有少量的精子细胞产生。这些结果表明类固醇激素对于精子发生的进行十分重要但并非必不可少。综上所述,脊椎动物除了斑马鱼均只有一个cyp11a1基因。cyp11a1在尼罗罗非鱼中呈现性二态性表达,主要表达于精巢Leydig细胞、卵巢鞘膜细胞和间质细胞以及头肾肾间细胞中。对cyp11a1突变鱼进行分析发现,皮质激素对于罗非鱼的压力应激很重要但对于个体存活不是必需的;雌激素对于罗非鱼雌鱼卵巢分化很重要;雄激素对于精子发生很重要但并非必不可少。本研究为今后深入分析皮质激素的生理意义及雌雄激素在鱼类性别分化和配子发生中的作用奠定了基础。