论文部分内容阅读
目的: 重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是由乙酰胆碱受体抗体引起，T细胞、B细胞依赖的补体参与的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)是目前最理想的人类重症肌无力模型。树突状细胞(dendritic cell，DC)能提呈抗原，能最大效能活化原始CD4+T细胞。树突状细胞有成熟和未成熟两种状态，未成熟状态能诱导免疫耐受或者延迟免疫应答。免疫抑制剂他克莫司多用于器官移植后的免疫排斥反应，可以影响树突状细胞的成熟状态。RelB是一种转录调控因子，RelB基因敲除的小鼠，在脾脏及胸腺的生发中心、边缘区和髓质区缺少树突状细胞结构。本研究的主要目的:利用人工合成大鼠来源的乙酰胆碱受体抗原肽构建大鼠EAMG模型。在体外用Fk506诱导大鼠髓源性树突状细胞生成耐受性DCs，进而治疗大鼠EAMG。探讨MG与RelB表达的相关性。期望能够为重症肌无力的治疗及诊断提供一个新的途径。 方法: 1、耐受性树突状细胞的制备及鉴定:利用大鼠骨髓制备细胞悬液，分别与终浓度为0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的Fk506共培养，6天后，流式检测各浓度下树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达情况。剩下的细胞培养至第10天，收获前18h部分细胞加入LPS，流式检测。 2、构建EAMG大鼠模型:在Lewis大鼠双肩及背部脊柱两侧各处皮下注射乳化完全的抗原50ul，共计200ul(PBS100ul，TB1mg，CFA100ul，Ag100ug)，记为0天。分别于第9天和第26天，在相同位置相同剂量二次、三次加强免疫，共计200ul(PBS100ul，IFA100ul，Ag100ug)。每天观察大鼠临床表现，做肌力检测，每日或隔日称量体重。 3、动物分组:动物分为四组，分别为他克莫司修饰的DCs组、未经他克莫司修饰的DCs组、他克莫司组、PBS对照组。在初次免疫后第8天和17天腹腔注射相应的DCs（2×106个/只）。初次免疫10天后，对照组大鼠每日或隔日给与腹腔注射PBS200ul，Fk506组大鼠每日或隔日给与腹腔注射Fk506溶液1mg/kg.次。观察每组大鼠并隔日称量体重，记录临床症状。 4、淋巴结细胞悬液制备:无菌取下大鼠腹主动脉旁、下颌下及腋窝淋巴结淋巴结，经研磨后制备悬液并计数。 5、细胞增殖实验:96孔板中，每孔加入4×105个淋巴结细胞，设置R97-116组和PBS组。培养40h，加入10ulCCK-8，避光培养4h后，450nm测OD值。 6、检测细胞周期:24孔板中加入淋巴结细胞悬液，分为R97-116组和PBS组，培养40和60h后收集细胞，逐滴加入-20℃预冷的乙醇中，4℃过夜。洗涤后加入PI染液，在4℃环境下避光30min，上机流式检测。 7、流式检测大鼠外周血中DCs表面共刺激分子的表达:留取各组大鼠外周血300ul，加入荧光标记抗体，避光30min，裂解红细胞，洗涤后流式检测。 8、ELISA检测大鼠外周血血浆中R97-116抗体含量:留取各组大鼠腹主动脉血浆，ELISA检测其R97-116抗体水平。 9、RT-PCR检测各组EAMG大鼠及MG患者外周血中RelB mRNA的水平。 结果: 1、流式检测结果表明，Fk506浓度为10ng/ml时培养出的DCs表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达水平与其他各浓度比最低(P＜0.05);培养6天的DCs比10天的低表达表面共刺激分子，有统计学差异。 2、经抗原免疫的大鼠外周血中AChR抗体水平比正常对照组高，imDCs治疗组和Fk506治疗组比PBS对照组和mDCs治疗组抗体低，具有统计学意义(P＜0.05)。imDCs治疗组和Fk506治疗组大鼠的临床评分和另外两组比明显降低，从第22天开始有显著差异，大鼠体重也有不同程度升高。 3、淋巴细胞增殖实验结果显示，在抗原肽刺激下imDCs治疗组和Fk506治疗组OD值和PBS对照组和mDCs治疗组比降低，具有显著性差异。细胞周期结果表明，培养40和60h后，imDCs治疗组和Fk506治疗组S期和G2/M细胞数量少，和其他组比具有统计学意义(P＜0.05)。 4、大鼠外周血DCs检测结果表明，imDCs治疗组大鼠外周血DCs高表达CD86分子，与其他组比具有显著性差异。 5、RT-PCR结果显示，大鼠EAMG组外周血中RelB mRNA表达水平与正常对照组比显著升高;imDCs治疗组和Fk506治疗组与PBS对照组和mDCs治疗组比，外周血中RelB mRNA表达水平下调，具有统计学意义。临床MG患者和正常体检者比，外周血中RelB mRNA表达水平同样上调，具有显著性差异。 结论: 1、Fk506能够在体外诱导大鼠髓源性DCs生成耐受性DCs。10ng/ml为最适诱导浓度，并且培养6天即能收获耐受性DCs。 2、利用人工合成的鼠源性R97-116肽段能够成功造出大鼠EAMG模型。 3、他克莫司修饰的DCs和Fk506均能降低重症肌无力大鼠的临床评分，增加一定体重，缓解临床症状。 4、他克莫司修饰的DCs和Fk506能诱导EAMG大鼠免疫耐受与降低大鼠血清抗乙酰胆碱受体抗体、抑制淋巴细胞增殖、下调RelB mRNA的表达水平有关。 5、造模成功的EAMG大鼠和临床MG患者外周血中的RelB mRNA表达水平升高，这说明重症肌无力的发生与RelB的表达密切相关。