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禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病,禽流感病毒变异频繁,所以不易控制。基因重组是流感病毒的一个重要进化机制,20世纪的3次流感病毒大流行及本世纪的甲型H1N1/2009流感病毒大爆发包括最近的H7N9亚型流感病毒流行都是不同亚型流感病毒重组的产物。研究并掌握流感的遗传变异和生物学特性,对有效防控禽流感疫情具有重要意义。西藏位于我国境内的中亚-印度候鸟迁徙路线上,生态环境独特,境内湖泊众多,是我国重要的候鸟聚集地,尤其是水域野鸟种类繁多。西藏特有的高海拔、高寒及气压低等特点有利于流感病毒的重组变异。西藏地区家禽养殖以散养为主,野鸟在家禽养殖区附近活动,极易与家禽发生接触,给流感病毒在野鸟及家禽间的双向传播提供了可能,加大了病毒基因重组的机会。为了掌握西藏地区禽流感病毒的遗传变异现状,本研究对2010年至2012年期间西藏部分地区进行了流感病毒的分离,并对分离株的基因组特征及生物学特性进行了研究,以期阐明近2年西藏地区禽流感病毒可能的遗传进化来源和潜在的危害性。主要研究内容和结果如下:1.西藏流感病毒的分离鉴定、全基因组测序与遗传进化分析本研究对西藏地区禽流感疑似病死鸡进行病料采集,病料研磨处理后接种鸡胚进行流感病毒分离,对HA和NA克隆测序和RT-PCR方法鉴定为混合感染的2010年林芝地区病料继续空斑克隆纯化,最终分离得到1株H5N2亚型和4株H5N1亚型禽流感病毒,分别命名为 A/chicken/Tibet/LZ01/2010(H5N2)、A/chicken/Tibet/LZO 2/2010(H5N1)、A/chicken/Tibet/LZ03/2010(H5N1)、A/chicken/Tibet/SN03/2011(H5N1)和 A/chicken/Tibet/LZ04/2012(H5N1)。其中 A/chicken/Tibet/LZ01/2010(H5N2)是首次从西藏地区分离到的H5N2亚型禽流感病毒。通过RT-PCR扩增5株西藏分离株的全基因组基因片段,PCR产物克隆到PGEM-T载体中进行序列测定,并对所得序列进行同源性及遗传进化分析。结果显示,5株H5亚型分离株的HA基因裂解位点处均含有多个碱性氨基酸位点,为“PLRERRRKRGL”或“PQRERRRKRGL”,具有高致病性禽流感病毒的特征。5株病毒都是H5N1与H9N2亚型禽流感病毒的基因重组产物。其中LZ01(H5N2)的表面基因NA和内部基因PB1、PA、NP都来源于H9N2亚型禽流感病毒,其余4个基因片段来源于H5N1亚型禽流感病毒。LZ02(H5N1)的PB1、PA及NP基因来源于H9N2亚型禽流感病毒,其余5个基因片段来源于H5N1。LZ 03(H5N1)及SN03(H5N1)的PB1基因来源于H9N2亚型禽流感病毒,其余7个基因片段都来源于H5N1。LZ04(H5N1)分离株的M基因来源于H9N2亚型禽流感病毒,其余7个基因片段均与09年以后青海、蒙古及江苏等地新分离到的H5N1亚型毒株同源。在遗传进化树上,LZ01(H5N2)、LZ02(H5N1)、LZ03(H5N1)和 SN03(H5 N1)之间亲缘关系很近,可能是相同的亲本毒株发生基因重组后形成的不同基因型重组产物。而LZ04(H5N1)单独处于另一进化分支,基因来源于不同的亲本毒株。2.西藏禽流感病毒分离株的感染性与致病性研究对LZ01(H5N2)和LZ02(H5N1)进行了比较生物学特性研究,结果显示两株毒对鸡胚均具有很强的感染致死性,ELD50为109.5/ml,最小致死剂量的鸡胚平均死亡时间MDT为42h,在犬肾上皮细胞MDCK上不需要胰酶即可以形成空斑,这些特性与包含多个碱性氨基酸序列HA裂解位点的HPAIV特征相符。然而,体外动物实验结果却不一致,LZ02(H5N1)的静脉接种指数IVPI=3,雏鸡脑内接种指数ICPI=1.7,小鼠半数致死剂量MLD50<103TCID50,对鸡和小鼠表现为高致病性;而LZ01(H5N2)毒株的IVPI=0.68,ICPI=0.27,MLD50>105TCID50,对鸡和小鼠表现为低致病性,病毒在鸡、鸭体内各组织都有分布,但增殖能力很弱。初步研究了毒力差异与NA基因的关系,红细胞洗脱试验结果表明H5N2的NA受体解吸能力显著强于H5N1,进一步检测了病毒的神经氨酸酶活性,结果没有明显差异。3.西藏流感病毒分离株的抗原性差异分析进一步对西藏分离株的抗原特性进行了研究。交叉血凝抑制实验结果表明,clade 2.3.4分支的LZ01毒株制备的高免血清只对LZ02、LZ02、LZ03及SN03毒株具有很高的血凝抑制效果,但是对LZ04、Re-5及其他clade2.3.2和clade2.3.4分离株基本没有血凝抑制效果。clade 2.3.2.1分支的LZ04毒株制备的高免血清对LZ01、LZ02、LZ03及SN03四株西藏分离株基本没有血凝抑制效果。抗原变异系数(R)也显示西藏分离株与Re-5疫苗株的具有极大的抗原性差异。我们评价了现行商用Re-5疫苗对LZ02(H5N1)及LZ04(H5N1)的免疫保护效果,结果显示Re-5可以有效的保护LZ04(H5N1)毒株攻毒鸡不死,对LZ02(H5N1)攻毒鸡只能提供80%的存活保护率。氨基酸序列分析发现LZ01、LZ02、LZ03及SN03四株病毒的HA蛋白高度同源,氨基酸序列完全相同。这四株病毒与Re-5疫苗株进行比较发现,在A、B、C三个抗原决定簇的氨基酸位点上都发生了突变。而LZ04分离株在抗原决定簇上的突变位点较少,因此Re-5对其具有较高的保护性。