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目的：1、观察不同剂量氯喹对戊四氮(Pentylenetrazole PTZ)激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞(astrocyte, Ast)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、α-氨基羟甲基异恶唑丙酸(amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid,AMPA-GluR2)受体及神经型一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase nNOS)表达的影响,研究氯喹对Ast增殖指标及活化状态的影响,探讨氯喹抗癫痫作用机制。2、观察不同剂量氯喹对PTZ慢性致痫大鼠动物模型脑内GluR2及nNOS表达的影响,研究慢性癫痫状态下,氯喹对Ast增殖及活化的影响机制,探讨氯喹抗癫痫作用机制。方法：实验一：体外Ast的激活及大鼠慢性癫痫模型的制备、干预及分组1、体外Ast的培养及激活新生24h内健康SD大鼠,雌雄不限,断颈处死后浸泡于75%乙醇5min消毒。分离海马,体式显微镜下剥离被膜,剪碎、离心,按106/cm2接种于25cm2细胞培养瓶,于37℃,5%CO2培养箱中进行培养,待细胞长满瓶底90%左右进行传代,获得的Ast经免疫荧光鉴定分组,分为对照组,PTZ激活组,PTZ+氯喹不同剂量组(25、50、75mg/L)。2、慢性癫痫大鼠模型的制备健康雄性SD大鼠50只,随机分为对照组(10只)和慢性癫痫模型组(40只)。对照组腹腔注射生理盐水,模型组给予0.5%PTZ溶液,40mg/Kg体重,每日上午8时注射一次,直至模型复制成功。根据Racine评分标准分为5级,凡连续至少5次II级以上发作者被认为造模成功。造模成功后给予维持量。将40只已成功致痫大鼠随机分为癫痫组和氯喹不同剂量干预组(20、40、60mg/kg体重),每组10只。连续观察动物给药后2小时内的行为表现和脑电变化。干预治疗2周。实验二：MTT检测氯喹对体外培养大鼠海马Ast激活状态的影响培养大鼠海马Ast,方法同上。经鉴定后的Ast进行传代培养,按8×104个/cm2的密度接种于96孔板,含10%胎牛血清培养基培养24h后,加入药物干预,每组6个复孔,每孔加入100μL含药培养基继续培养24h后,弃培养基,D-Hanks洗2遍,运用MTT比色法检测各组Ast的活细胞数量。于酶标仪上测OD值,测定波长490nm,以OD值反映各组Ast活细胞的数量。实验三：免疫荧光检测各组Ast GFAP的表达。培养大鼠海马Ast并激活,方法同上,细胞经鉴定后传代,传代细胞进行爬片,37℃,5%CO2培养箱孵育24h,用5%胎牛血清培养基配制药物,分组,运用免疫荧光法检测各组Ast GFAP的表达。荧光倒置显微镜照相观察,于病理图像分析系统分析积分光密度值,以积分光密度值(IOD)反映各组细胞的情况。实验四：western blot检测各实验组GluR2及nNOS的表达。体外培养大鼠海马Ast,采用MK-801阻断剂阻断NMDA受体通路,再以戊四氮激活,行氯喹干预。冰上提取各实验组蛋白。采用western-blot方法检测各实验组大鼠海马GluR2及nNOS蛋白含量的表达。扫描图像,分析各实验组条带的灰度值,以目的蛋白的灰度值来比较不同实验组蛋白的表达量。实验五：免疫组化检测各实验组GluR2及nNOS的表达。按分组制备动物模型,方法同上。冰上提取实验动物双侧大脑皮质和海马组织,4%多聚甲醛固定,常规组织处理、制片。采用免疫组织化学方法检测GluR2及nNOS在不同组织中的表达。采用HPLAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统进行图像分析,每张切片在10×40倍视野下随机取10个视野,计数阳性细胞数量,取其平均值；同时测定阳性细胞的光密度值(OD),取其平均OD值。结果：(一)细胞培养结果1、原代培养的大鼠海马Ast,荧光倒置显微镜下可见细胞生长较好,贴壁良好,胞突明显,细胞向外伸出长短不一的突起,细胞质中可见清晰的卵圆形细胞核,胞质丰富。原代培养的细胞经免疫荧光鉴定,GFAP免疫反应阳性率达90%以上。2、MTT结果提示：PTZ可以显著激活体外培养的大鼠海马Ast(P<0.05),使其形态发生改变；氯喹对PTZ激活的细胞活性具有显著的抑制作用,随着氯喹剂量的不断增加,抑制作用逐渐增强,其中以75mg/L浓度的氯喹抑制效果最好,可以将OD值维持在正常范围(P<0.05)。3、免疫荧光结果：与对照组相比,PTZ可显著激活体外培养的大鼠海马Ast,使GFAP表达增加(P<0.05),不同剂量氯喹可以抑制PTZ对体外培养大鼠海马Ast的激活,使GFAP表达降低,且以氯喹75mg/L剂量组抑制效果最好,可将IOD值维持在正常范围(P<0.05)。4、 western-blot结果显示：与对照组比较,GluR2在PTZ激活组含量降低,差异具有显著性(P<0.05),与PTZ激活组相比,随着氯喹干预剂量的增加,GluR2的含量增加,其中75mg/L浓度的氯喹作用效果明显,差异具有显著性(P<0.05)。与对照组相比,nNOS在PTZ组含量最高,差异具有显著性(P<0.05),随着氯喹剂量的增加,nNOS的含量降低(P<0.05)。(二)动物实验结果1、行为学观察：大部分实验动物经腹腔注射给药后约7天(d)后首次出现IⅡ级以上发作,全部动物注射14d后均出现Ⅱ级以上发作。对照组无痫样发作,氯喹干预1组与癫痫组相比无显著性差异(P>0.05)；其余两个干预组与癫痫组相比均有显著性差异(P<0.05)。2、脑电记录：对照组无痫样放电,出现平缓、低平的波形；癫痫组呈现频发高幅的尖波、棘波、棘慢波或棘慢复合波,干预组显示慢波和小棘波,随干预剂量的增加,癫痫波减弱。3、western blot检测结果：与对照组比较,GluR2在PTZ致痫组含量降低,差异具有显著性(P<0.05),与PTZ致痫组相比,随着氯喹干预剂量的增加,GluR2的含量增加,其中40、60mg/Kg浓度的氯喹作用效果明显,差异具有显著性(P<0.05)。与对照组相比,nNOS在PTZ致痫组组含量最高,差异具有显著性(P<0.05),随着氯喹剂量的增加,nNOS的含量降低(P<0.05)。4、免疫组化检测结果：GluR2与nNOS均以胞浆被染成棕褐色为阳性结果,阳性细胞为神经元细胞。与对照组相比,GluR2在PTZ组表达最低,差异具有显著性(P<0.05),氯喹干预组GluR2表达较PTZ组增加,以40和60mg/Kg体重剂量组效果明显,具有显著差异(P<0.05)。nNOS与对照组相比,在PTZ致痫组的海马CA1区与DG区表达均强,差异具有显著性(P<0.05),氯喹干预40、60mg/Kg组与PTZ组相比,nNOS在海马CA1区与DG区表达均降低,差异具有显著性(P<0.05),氯喹干预40、60mg/Kg组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。nNOS在DG区的表达不如CA1区强,差异无显著性(P>0.05)。结论：(一)细胞培养1、10mmol/L的PTZ可显著激活体外培养的大鼠海马星形胶质细胞。2、致痫因子(PTZ)可通过激活AMPA受体通路,调节AMPA受体的亚单位GluR2及nNOS的表达发挥致痫作用。3、氯喹可以抑制PTZ激活的体外培养的大鼠海马星形胶质细胞的增殖,并且随着干预剂量的增加,抑制作用逐渐增加,其中以75mg/L抑制作用最佳。4、氯喹可以抑制PTZ激活的体外培养的大鼠海马星形胶质细胞GFAP的表达,从而抑制Ast的活性。5、氯喹可以通过干预AMPA受体的亚单位GluR2及nNOS的表达,从而达到抑制星形胶质细胞活性的目的。(二)动物实验1、利用0.5%PTZ溶液可以成功复制慢性癫痫动物模型,癫痫发生与Ast过度增殖密切相关。2、氯喹对PTZ慢性致痫大鼠癫痫发作状态具有一定的抑制作用,并且随干预剂量的增加抑制作用呈现增强后趋于某一稳定状态。3、氯喹可通过调节GluR2及抑制nNOS的表达,从而抑制慢性癫痫大鼠的痫样发作,进而起到抗癫痫的作用。