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研究背景和目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC,以下简称肝癌)是全球第三大肿瘤致死性疾病,在我国每年因肝癌或其相关疾病而死亡的人数达13万人次。手术仍然是目前最有效的肝癌治疗手段。然而,由于肝癌起病隐匿,发展迅速,往往在发现时已处于中晚期,丧失了手术机会,因此越来越多的患者接受非手术治疗,如经肝动脉化疗栓塞术(Transcatheter arterial chemoembolization, TACE)。利卡汀(Licartin)是一个同位素标记的单克隆抗体,其靶点是包括肝癌细胞在内的多种肿瘤细胞表面高表达的CD147蛋白。通过介入手段进入肿瘤内,利卡汀除了特异性与肝癌细胞表面CD147结合封闭其相关信号通路外,自身荷载的放射性1311也通过释放β射线直接杀伤肝癌细胞。作为一个放射免疫治疗的靶向药物,利卡汀自上市以来得到了较多关注,其发挥的临床疗效也得到了认可,多组临床数据表明TACE+利卡汀联合方案优于单纯的TACE治疗。然而,我们注意到,对于这样一个分子靶向药物,临床上并没有建立和应用指导利卡汀个体化治疗的实验室筛查技术。至于受检样本,在接受非手术治疗的肝癌患者无法获取或需要反复获取肝癌样本的情况下,传统的手术切除或活检样本并不能满足要求,而我们认为有“液体活检”(Liquid biopsy)之称的循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells, CTCs)可能是理想的可替代检测样本。近年来,我们逐步建立和优化了肝癌CTCs分离和鉴定技术。在富集肝癌CTCs方面,选择Ficoll密度梯度离心结合磁性激活细胞分选术(Magnetic activated cell separation, MACS)分选方法中的去除分选策略。通过CD45磁珠标记血液中的淋巴细胞,经过分选磁场时被标记的淋巴细胞被吸附滞留于磁场中的分选柱中,而未被标记的细胞(含CTCs)则流出分离柱而被收集。这一策略减低了肿瘤细胞异质性对阳性分选效率的影响。在鉴定肝癌CTCs标志物的选择上,我们在比较多个指标后选择了具有肝癌细胞特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoproteinreceptor, ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1 (Carbamyl phosphate synthetase 1, CPS1)的混合指标,有助于提高鉴定的阳性率。在建立并验证多色免疫荧光染色方法的可行性时,我们除了选取利卡汀的靶点CD147外,还选取了上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM),这一在肝癌中可能作为肝癌干细胞样标志的蛋白作为另一个鉴定的目的蛋白。在评价该方法的可行性后,选择经利卡汀治疗的肝癌患者,检测肝癌CTCs CD147表达情况,并结合肝癌患者临床随访资料,探讨肝癌CTCs的CD147分子表型鉴定对于指导临床利卡汀个体化治疗的应用价值。方法1、建立多色免疫荧光染色技术分析肝癌CTCs表达CD147或EpCAM的方法学,并研究CTCs与组织样本之间CD147分子表型的相关性。(1)采用Ficoll密度梯度离心结合MACS去除分选方法富集肝癌CTCs血液模型。(2)应用ASGPR+CPS1/CD147或EpCAM/CD45四抗体(分三组,三色)建立鉴定肝癌CTCs表达目的蛋白的四色免疫细胞荧光染色方法(第四色为细胞核衬染)。(3)采用上述方法四色免疫细胞荧光染色方法检测32例肝癌患者CTCs中CD147或EpCAM表达情况,了解肝癌CTCs的CD147、EpCAM表达谱。(4)采用免疫组织化学染色方法检测对应32例肝癌组织的CD147表达情况,比较肝癌CTCs与对应肝癌组织CD147表达检测结果,分析二者之间的相关性。2、检测92例接受TACE+利卡汀治疗或TACE单纯治疗的肝癌患者CTCs及其CD147表达,比较治疗前后CTCs数量以及CD147表达谱变化情况,收集并统计相关临床资料以及随访生存信息,分析并评价肝癌CTCs计数及其CD147分子分型在指导利卡汀个体化治疗中的应用潜能。结果1、ASGPR+CPS1/CD45鉴定指标可准确鉴别出富集样品中的肝癌CTCs,而基于多色免疫荧光染色技术可以准确检测不同CTCs中CD147或EpCAM的表达差异。在受检的32例肝癌患者中,29例为CTCs阳性,占91%。每5mL血液样本中检出CTCs数目最少为4个,最多可达62个,平均28±16个。而15例健康志愿者和12例其他恶性肿瘤患者外周血中均未检出CTCs。在29例CTCs阳性患者中,20例检出CD147+ CTCs,占69%,5例检出EpCAM+ CTCs,占17%。而在检出CD147+或EpCAM+ CTCs的个体中,也发现有不等量的CD147-或EpCAM- CTCs的存在。2、在对比研究的32例患者中,29例患者可检出CTCs,阳性率达91%。我们定义凡发现有CD147+或EpCAM+的CTCs存在,其对应的患者即为CD147+或EpCAM+个体。在29例CTCs阳性患者中,有20例(69%)患者CTCs中存在CD147+CTCs细胞,5例(17%)中存在EpCAM+细胞CTCs。在29例CTCs阳性患者对应的肝癌组织中,有22例(76%)为CD147+。对比两种样本中CD147检测结果,共有27例两种样本的检测结果一致,其中有20例,两种检测结果检出均为CD147+,7例均为CD147-个体,总符合率达93.1%(27/29)。统计分析结果显示两种样本的检测方法检测结果无明显差异性(P>0.05)。3、检测52例接受TACE+利卡汀和40例接受TACE单纯治疗(TACE组)的肝癌患者(共计92例)CTCs及其CD147表达情况。结果显示,86例患者为CTCs阳性,6例未检出CTCs, CTCs阳性率达93%。TACE组95.0%(38/40)患者为CTCs阳性,CTCs检出数5-76个,平均38±15；而TACE+利卡汀组92.3%(48/52)患者为CTCs阳性,CTCs检出数2-78个,平均36±13个；统计学分析显示两组患者CTCs阳性率及数目无明显差异(P>0.05)。4、对86例CTCs阳性患者进行CTCs CD147分子分型,结果显示,58例为CD147+,阳性率为67%(58/86)。其中33例在TACE+利卡汀组,阳性率为69%(33/48)；25例在TACE组,阳性率为66%(25/38)。不同患者和同一患者不同CTCs之间CD147表达不同,在CD147+CTCs存在的患者中检测出CTCs中CD147+细胞所占比率也不尽相同,其外周血中也并且存在CD147-的CTCs。5、86例CTCs阳性患者接受治疗后1个月,外周血CTCs均有不同程度的下降。在TACE+卡汀组(n=48),CTCs数目从治疗前36±13个下降到治疗后21±11个,差异具有显著性(P<0.001)。CD147+患者(n=33)在治疗前后的CTCs数目(38±12个 vs.19±9个)变化存在显著差异性(P<0.001),而CD147-患者(n=15)在治疗前后的CTCs数目(30±11个vs.26±13个)变化无显著差异(P=0.343)。对比CD147+和CD147-两种表型患者在接受治疗前后CTCs数目差值之间(19±8个vs.4±8个)具有显著差异性(P<0.001),提示CD147+患者对利卡汀敏感。在TACE组(n=38),CTCs数目从治疗前38±15个下降到治疗后29±16个,差异具有显著性(P=0.018),而对比CD147+患者(n=25)和CD147-患者(n=13)治疗前后CTCs数目差值之间(10±8个vs.6±10个)未见显著差异(P=0.252)。6、TACE+利卡汀组(n=48)和TACE组(n=38)CTCs数目之间在治疗前(36±13个vs.38±15个)无显著差异性(P=0.524),而在治疗后2组CTCs数值变化之间(14±11个vs.9±9个)显示出显著差异性(P=0.009)。CD147+患者在不同治疗组(TACE+利卡汀组33例,TACE组25例)的疗效：治疗前CTCs数目(38±12个 vs.42±14个)无显著差异性(P=0.247),治疗后2组CTCs数目变化之间(19±8个 vs.10±8个)显示出显著差异性(P<0.001),而CD147-患者(TACE+利卡汀组15例,TACE组13例)治疗后CTCs数目变化之间(4±8个vs.6±10个)无显著差异性(P=0.549)。结论本研究建立的多色免疫荧光染色方法简便实用,可用于肝癌CTCs CD147或EpCAM表型鉴定。肝癌CTCs可替代肝癌组织样本进行CD147分子表型检测。不同肝癌个体及同一肝癌个体不同CTCs之间CD147表达显示出异质性。肝癌CTCsCD147表型检测可能有助于指导临床利卡汀的个体化治疗,以及进行动态监测和实时疗效评价。对CD147+患者推荐积极应用利卡汀治疗,而对CD147-患者则不推荐。