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黄芩为唇形科(Labiatae)植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根,是一味传统的常用中药。随着目前对黄芩苷研究的深入,发现黄芩苷具有抗肿瘤、抗HIV等作用。以黄芩为资源,开发新的药物前景将十分广阔,又因黄芩为多年生草本植物,生长较慢,将会造成黄芩资源短缺,限制黄芩产品深度开发。利用黄芩毛状根培养将使黄芩苷的生产实现工程化生产,生产过程进行标准化管理,有着重要的经济价值,同时将促进我国利用黄芩毛状根培养生产黄芩苷的研究及新的黄酮类药物资源开发。
本课题是将现代生物技术与传统中药相结合,在国内首次提出黄芩毛状根培养系统的研究,建立中药黄芩毛状根离体培养体系,为黄芩苷的生产开辟新途径。鉴于黄芩为双子叶植物及国外有关黄芩属植物毛状根培养研究的报道,利用发根农杆菌感染黄芩获得毛状根是完全可行的。
本文利用发根农杆菌A4菌株,A4 9615菌株和1.2556菌株等侵染黄芩及其外植体,通过对发根农杆菌的选择、外植体的选择、农杆菌侵染条件的优化、除菌条件的确定、毛状根鉴定,建立黄芩的毛状根离体培养体系并对黄芩毛状根培养条件优化,富集黄芩苷。
研究表明,发根农杆菌A4,A4 9615和1.2556侵染黄芩均能产生毛状根,其中A4菌株侵染率最高,外植体以黄芩茎段较好,发根农杆菌预培养时间为2天,添加300μg/mL乙酰丁香酮,侵染时间为20分钟,共培养时间为2天,共培养的培养基为MS,转入1/2MS,毛状根除菌培养基添加500mg/L氨苄西林钠的培养条件最佳,黄芩毛状根诱导率达40%。
将发根农杆菌诱导的黄芩根与激素诱导的黄芩根进行比较后发现,发根农杆菌诱导的黄芩根在形态上分枝多、生长迅速、无向地性、且不需添加外源激素,经过反复多次继代培养后,仍能够保持原来的特性,而激素诱导的黄芩根在不含激素的培养基中继代培养,根基本不生长,很少产生分枝,且逐渐死亡,这些特点说明发根农杆菌诱导获得的黄芩根确为黄芩毛状根。
黄芩毛状根液体培养的最佳条件:以1/2MS培养基为基本培养基,pH在5.8-6.0之间,采用5%蔗糖为碳源,0.5g/L水解乳蛋白为氮源,28℃,110r/min,装液量为250mL的三角瓶中装100mL培养基,在暗处下培养30天较好,黄芩毛状根生长量达23.37g(鲜重)/瓶。
通过薄层色谱法、紫外扫描法对黄芩毛状根培养液及提取液进行成分分析,确定黄芩毛状根提取液中含有黄芩苷;通过HPLC法定量测定黄芩毛状根中黄芩苷含量,测定结果表明,培养30天的黄芩毛状根中黄芩苷的含量达4.85%。