神经管畸形(NTD)是由于胚胎发育早期神经管不闭合或闭合不完全引起的一类严重的出生缺陷,由环境及遗传因素共同作用引起。目前的研究已证实平面细胞极性信号通路中Vangl2基因与该疾病的发生密切相关。随后在小鼠模型中证实包被复合物Ⅱ (COPⅡ)转运蛋白Sec24b蛋白能够特异性地与Vangl2蛋白结合,介导Vangl2蛋白从内质网至高尔基体的转运。而且Sec24b基因突变会影响Vangl2蛋白由内质网向高尔基体的运输过程,引起小鼠出现神经管畸形。本实验室前期的研究发现人类神经管畸形患者SEC24B基因编码区特有的四个错义突变(F227S、 F682L、R1248Q及A1251G),但其功能有待验证。同时由于无法在人体直接研究该基因的功能,能否用斑马鱼作为平台来研究也是有待解决的问题。本研究的内容及结果如下：1.Sec24b基因的生物信息学分析从NCBI数据库下载人和斑马鱼等生物的SEC24B基因序列,用生物信息学软件进行分析。结果表明：人类和斑马鱼的SEC24B基因的相似度为77%。2.斑马鱼Sec24b基因的克隆及功能分析(1)提取斑马鱼的总RNA, RT-PCR技术克隆Sec24b基因,测序验证；(2)用合成的地高辛标记的Sec24b基因反义RNA探针进行整胚胎原位杂交及冰冻切片,检测Sec24b基因在胚胎不同发育时期的表达；(3)反义干扰实验：用吗啡啉(Morpholino)标记的反义寡核苷酸与mRNA结合,阻断翻译,观察对胚胎表型的影响；(4)过表达实验：将SEC24B-WT、SEC24B-Y613和空载体质粒分别注射斑马鱼胚胎,观察SEC24B基因野生型及突变体过表达引起的效应；(5)体外挽救实验：以人源SEC24B-WT、SEC24B-Y613X和Sec24b-EGFP质粒分别与Sec24b-MO共注射受精卵,观察统计胚胎表型变化。结果：①成功克隆到斑马鱼Sec24b基因,长度为495bp,可用于作为下一步的探针模板；②整胚胎原位杂交发现,在胚胎发育早期Sec24b存在母效表达效应,信号广泛分布于胚胎细胞内,从尾芽期开始,深染部位集中于脑部和神经组织,说明Sec24b表达开始出现组织特异性。受精后36个小时,Sec24b表达集中在脑部、视囊、软骨等部位,其他区域已经检测不到Sec24b信号；③吗啡啉修饰的反义寡核苷酸(Sec24b-MO)进行基因敲低后发现,注射后胚胎脑部体积明显减小眼睛发育不完全,体长缩短,体轴弯曲等类似Vangl2基因突变引起的表型；④过表达实验发现,汇聚延伸作用受到精确的剂量调控,不足或过量均可以引起汇聚延伸作用异常；⑤挽救实验证实,人的SEC24B基因可以对斑马鱼的该基因表现出补救效应。因此,斑马鱼模型可以作为人类SEC24B基因突变的功能验证系统。4.人类神经管畸形患者SEC24B基因突变体相关功能分析借助斑马鱼体系和细胞体系,分析错意突变的SEC24B基因表达情况及SEC24B蛋白与VANGL2蛋白的生化互作产生影响及细胞内的定位情况,验证SEC24B基因是否与NTD的发生相关。本部分内容包括：(1)构建带有Myc标签的野生型及突变型表达载体(pCMV6-SEC24B-F227S-myc, pCMV6-SEC24B-F682L-myc, pCMV-SEC24B-R1248Q-myc, pCMV6-SEC24B-A1251G-myc),分别转染至HKE293T细胞,Westemblot检测表达：(2)随后用免疫共沉淀确定SEC24B蛋白与VANGL2蛋白在细胞内的作用情况；(3)用siRNA沉默内源Sec24b基因,转入外源野生及突变型质粒,通过荧光共定位技术及免疫组化检测野生及突变型SEC24B蛋白与VANGL2蛋白的共定位情况；(4)分别用不同浓度的野生型及5种突变型的质粒与Sec24b-MO共注射斑马鱼胚胎,进行体外挽救实验,观察胚胎表型变化情况。结果表明：(1)F227S、F682L突变后其在细胞内的表达稳定性降低了,表达量明显低于野生型；(2)免疫共沉淀的结果也显示这两处突变影响了SEC24B蛋白与VANGL2蛋白的互作,导致SEC24B蛋白与VANGL2蛋白的相互作用的减弱甚至丧失；(3)细胞内荧光共定位及免疫组化结果显示,F227S和R1248Q改变了Vangl2蛋白由内质网的运出方式,使Vangl2蛋白大量的滞留于内质网,而R1248Q、 A1251G突变导致Vangl2蛋白部分滞留于内质网,F682L对Vangl2蛋白的运输情况影响不明显；(4)体内挽救实验发现：4个突变体都不能明显挽救胚胎畸形,F682L和R1248Q可以部分挽救畸形。结论：Sec24b基因功能的缺失会影响VANGL2的运输,造成斑马鱼出现类似神经管畸形的表型；人SEC24B基因在一定程度上可以对斑马鱼Sec24b敲低进行补救；人SEC24B基因4个错意突变中,只有F227S突变会导致SEC24B功能的完全丧失。斑马鱼可以作为研究PCP信号途径中核心基因突变与NTD相关性研究的平台。