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干旱作为主要的非生物胁迫之一,严重影响植物的正常生长发育。随着全球气候变暖,干旱已经成为制约全球农业发展的巨大瓶颈,严重威胁世界粮食安全。由于植物具有不可移动性,所以在长期进化过程中,植物自身进化出一套独特的保护机制来抵御非生物胁迫,深入解析植物干旱响应调控机理对于改良植物耐旱性,尤其是培育耐旱作物具有重要意义。脱落酸(ABA)是一种天然生成的植物激素和生长调节剂,研究表明ABA在调控干旱胁迫应答反应中发挥重要作用。抗坏血酸(AsA)是植物中主要的抗氧剂,有利于植物清除非生物胁迫所造成的氧化伤害,广泛报道参与植物抵御非生物逆境。尽管很多研究报道ABA和AsA参与调控植物非生物逆境响应,但二者间是否存在联系,如何协同调控干旱胁迫应答至今仍然未知。
本研究通过对本实验保存的140份未知功能的拟南芥磷酸酶类基因的T-DNA插入突变体材料进行干旱表型筛选,鉴定了一个干旱敏感型突变体,并克隆了T-DNA插入所破坏的基因AtPTPN(PTP-like Nucleotidase ),进一步以AtPTPN作为候选基因开展了系统性的基因功能验证和分子机理解析相关研究工作。系统发生学分析结果表明该基因序列在各物种中相似性很高,极高的保守性预示着该基因可能具有重要的生物学功能;表达谱分析结果表明,AtPTPN基因在多组织器官中均有表达,并且其转录水平能够受到ABA以及干旱的诱导;表型分析结果表明,相较于野生型材料,Atptpn突变体对外源ABA处理不敏感,对干旱胁迫更加敏感。在Atptpn突变体中外源表达AtPTPN基因能够恢复Atptpn突变体的ABA不敏感表型以及干旱敏感表型。超量表达AtPTPN显著增强拟南芥对ABA的敏感性以及对干旱胁迫的耐受性,证实AtPTPN在调控植物干旱胁迫应答反应中发挥重要作用。通过序列比对,我们进一步发现并克隆了玉米基因组中与AtPTPN序列相似性最高的基因ZmPTPN(氨基酸序列相同性达72%)。组成型过量表达ZmPTPN显著提高玉米苗期抗旱性。RNA干涉下调ZmPTPN表达则显著降低玉米苗期抗旱性,证明玉米ZmPTPN与拟南芥AtPTPN功能相近,均为干旱胁迫应答反应中的正调控子。以上结果表明,PTPN抗旱功能在高等植物中十分保守。
为了进一步解析PTPN调控植物耐旱分子机理,本研究进一步筛查了PTPN的作用底物,通过底物筛查我们发现PTPN蛋白具有典型的核苷酸酶活性,能够水解GDP/GMP/dGMP/IMP/dIMP等核苷酸,释放Pi。VTC2是植物AsA生物合成途径中的限速酶,本研究发现,PTPN能够通过调控拟南芥中局部Pi的含量影响由VTC2控制的限速步骤,调控植物体内的AsA合成。超量表达AsA合成途径的限速酶编码基因VTC2能够显著提高植株的AsA含量,提高拟南芥的抗旱性,并且部分依赖于AtPTPN的功能。以上结果说明VTC2与AtPTPN在AsA生物合成和干旱胁迫应答反应中存在遗传互作。通过酵母单杂交实验,我们筛选到热激蛋白转录因子HSFA6a能够特异性结合AtPTPN启动子上的HSE(heat shock factor binding element)位点,并激活其表达。遗传分析结果显示,HSFA6a调控ABA和干旱应答反应的功能部分依赖于AtPTPN。
综上所述,我们发现了一个全新的抗旱基因PTPN。一方面,该基因由HSFA6a介导参与ABA应答反应,另一方面该基因作为核苷酸酶调控AsA的合成。该基因作为一个中枢分子,将ABA信号通路与AsA合成通路结合起来,共同参与植物干旱胁迫应答反应。PTPN基因的发现及其抗旱机理解析,为作物抗旱品种选育提供新的遗传资源和理论依据。
本研究通过对本实验保存的140份未知功能的拟南芥磷酸酶类基因的T-DNA插入突变体材料进行干旱表型筛选,鉴定了一个干旱敏感型突变体,并克隆了T-DNA插入所破坏的基因AtPTPN(PTP-like Nucleotidase ),进一步以AtPTPN作为候选基因开展了系统性的基因功能验证和分子机理解析相关研究工作。系统发生学分析结果表明该基因序列在各物种中相似性很高,极高的保守性预示着该基因可能具有重要的生物学功能;表达谱分析结果表明,AtPTPN基因在多组织器官中均有表达,并且其转录水平能够受到ABA以及干旱的诱导;表型分析结果表明,相较于野生型材料,Atptpn突变体对外源ABA处理不敏感,对干旱胁迫更加敏感。在Atptpn突变体中外源表达AtPTPN基因能够恢复Atptpn突变体的ABA不敏感表型以及干旱敏感表型。超量表达AtPTPN显著增强拟南芥对ABA的敏感性以及对干旱胁迫的耐受性,证实AtPTPN在调控植物干旱胁迫应答反应中发挥重要作用。通过序列比对,我们进一步发现并克隆了玉米基因组中与AtPTPN序列相似性最高的基因ZmPTPN(氨基酸序列相同性达72%)。组成型过量表达ZmPTPN显著提高玉米苗期抗旱性。RNA干涉下调ZmPTPN表达则显著降低玉米苗期抗旱性,证明玉米ZmPTPN与拟南芥AtPTPN功能相近,均为干旱胁迫应答反应中的正调控子。以上结果表明,PTPN抗旱功能在高等植物中十分保守。
为了进一步解析PTPN调控植物耐旱分子机理,本研究进一步筛查了PTPN的作用底物,通过底物筛查我们发现PTPN蛋白具有典型的核苷酸酶活性,能够水解GDP/GMP/dGMP/IMP/dIMP等核苷酸,释放Pi。VTC2是植物AsA生物合成途径中的限速酶,本研究发现,PTPN能够通过调控拟南芥中局部Pi的含量影响由VTC2控制的限速步骤,调控植物体内的AsA合成。超量表达AsA合成途径的限速酶编码基因VTC2能够显著提高植株的AsA含量,提高拟南芥的抗旱性,并且部分依赖于AtPTPN的功能。以上结果说明VTC2与AtPTPN在AsA生物合成和干旱胁迫应答反应中存在遗传互作。通过酵母单杂交实验,我们筛选到热激蛋白转录因子HSFA6a能够特异性结合AtPTPN启动子上的HSE(heat shock factor binding element)位点,并激活其表达。遗传分析结果显示,HSFA6a调控ABA和干旱应答反应的功能部分依赖于AtPTPN。
综上所述,我们发现了一个全新的抗旱基因PTPN。一方面,该基因由HSFA6a介导参与ABA应答反应,另一方面该基因作为核苷酸酶调控AsA的合成。该基因作为一个中枢分子,将ABA信号通路与AsA合成通路结合起来,共同参与植物干旱胁迫应答反应。PTPN基因的发现及其抗旱机理解析,为作物抗旱品种选育提供新的遗传资源和理论依据。