研究背景与目的在西方国家,大肠癌是排列在第3位的常见的癌症死因,现在我国大肠癌发病率呈现上升的趋势。手术是治愈早期大肠癌的有效手段,但是通常大肠癌在发生转移之前患者并没有明显的症状,这就导致其高的死亡率。从而,致力于有效监测和预防大肠癌进一步发展的方法的研究很有必要。传统的预测大肠癌预后的最重要的指标是肿瘤的病理分级及诊断时的肿瘤分期(TNM或Dukes分期),分期包括原发肿瘤侵及的组织深度和层次,原发肿瘤是否有转移到区域淋巴结以及在远处其他器官是否形成转移灶。目前已经有很多的分子标志也应用于各种肿瘤预后的预测,这其中也包括在大肠癌方面的研究。这些分子标志能够预测大肠癌复发和转移的危险度,而仅仅通过传统的临床病理变量的分析则很难达到这样的预测作用。ABCG2,又称作BCRP(breast cancer resistance protein)或ABCP(placental ABC protein)或MXR(mitoxantrone resistance protein),是ABC (ATP binding cassette)转运蛋白G亚家族中的第2个基因/蛋白。ABCG2作为位于细胞膜上的转运蛋白,通过水解ATP而获得能量将与其相关的底物泵出细胞膜。众所周知,ABCG2与多药耐药相关,能够泵出米托葸醌、托普替康、伊立替康、甲氨碟呤等药物,从而使得肿瘤产生耐药性及治疗的失败。ABCG2能够泵出细胞核染料Hoechst33342,从而作为SP表型(side population)的决定分子,进而与干细胞相关。另外,有研究表明,ABCG2通过降低血红素代谢产物的累积,保护细胞免受缺氧相关的损伤,提示ABCG2在干细胞中的保护作用。ABCG2作为分子标记,它的表达与AML(急性髓细胞性白血病),ACLL(成人急性淋巴细胞性白血病),非小细胞性肺癌,小细胞肺癌和食道鳞癌的不良预后相关。Gupta等人的研究表明,正常大肠组织ABCG2的mRNA水平及蛋白水平的表达比大肠癌组织中的要高,但是此研究中只有13例大肠癌组织,而用免疫组化的方法在研究蛋白水平表达的时候,并没有说明ABCG2抗体的克隆表位。文献报道抗体为BXP-21的克隆较BXP-34的克隆更适合ABCG2的免疫组化染色。Diestra等运用免疫组化的方法用BXP-21克隆的抗体检测了150例21种未经过治疗的实体肿瘤的ABCG2的表达情况,其中12例大肠癌组织中,10例是中至高强度的表达,1例是较弱的表达,1例是阴性表达。因为例数较少,并没有结合临床的病理学资料分析ABCG2的表达与大肠癌病理学特点的关系。Glasgow等人比较了21例粘液腺大肠癌和30例Dukes C期非粘液腺大肠癌的ABCG2的mRNA表达水平,虽然粘液腺癌的预后要差于非粘液腺癌,但是结果表明这两种类型的大肠癌在mRNA表达水平上没有差异。迄今为止,在大肠癌中,没有研究数据表明ABCG2的表达和临床病理学变量和患者生存率的关系。ABCG2作为ABC (ATP binding cassette)转运蛋白超家族中的成员,与多药耐药和SP (side population)表型相关。本研究的目的,阐明ABCG2在大肠癌的表达方式,同临床病理学变量以及患者生存率的关系,评估ABCG2在预测大肠癌预后方面的作用。材料和方法1.病例选取惠州市中心人民医院病理科2003年1月至2005年12月期间诊断为大肠癌的术后病理组织标本225例(年龄,19岁至83岁；平均年龄57岁)。所有经过染色后的病理切片,均采用双盲法,由两名病理科医师各自独立阅片评分,如果结果有争议,经过协商统一后进行评分。并且病例都是来源于诊断为原发性大肠癌,没有接受过新辅助放化疗、没有其他恶性疾病的患者。全部病例按WHO肿瘤分类标准(大肠癌)进行组织学分型、区域淋巴结及Duke分期。此研究经惠州市中心人民医院伦理委员会批准,患者均已签署知情同意书。在所有的225个病例中,进行随访的病例有69例(30.7%),随访时间是60个月。随访的69例中,27例(39.1%)在随访期间死亡,他们的中位生存时间是12.1个月。2.免疫组化染色(SP法)福尔马林固定石蜡包埋的大肠癌组织行4μm的切片,切片组织置于防脱玻片上,经过二甲苯脱蜡及梯度酒精水化。载有病理切片组织的玻片置于0.01M枸橼酸(PH=6.0)抗原修复液中,在微波炉中保持沸腾的状态加热10分钟,随后从微波炉中取出后自然冷却至常温。用0.3%H202作用于切片组织20分钟,以封闭内源性过氧化物酶。山羊非免疫血清作用于切片组织20分钟,以封闭非特异性抗原。用一抗稀释液将ABCG2抗体(BXP-21, Abcam, England)1：40稀释后,滴加于切片组织上,切片组织置于湿盒中,并将湿盒放置在冰箱中,让切片组织在4℃孵育过夜。链霉素生物素法检测抗原,生物素标记的二抗在常温下孵育30分钟,链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶常温下孵育30分钟。加DAB于切片组织上,在显微镜下观察显色情况。苏木素复染细胞核后,将组织切片脱水并用中性树胶封片。免疫组化染色后的病理切片,由2名病理医师,在双盲原则下,各自独立阅片进行评分,若有争议,按协商原则进行评分。ABCG2在大肠癌中呈现细胞膜和细胞浆的染色,分别对于这两种染色进行半定量的评分,分为阴性,轻度阳性,中度阳性和强阳性。首先按照组织染色强度评分：0分为无染色,1分为淡黄色,2分为黄色,3分为棕褐黄色；其次根据ABCG2表达的阳性细胞数的比例评分：1分为阳性细胞数占总细胞数<=10%,2分为阳性细胞数占总细胞数11%～30%,%,3分为阳性细胞数占总细胞数31%-50%,4分为阳性细胞数占总细胞数>50%。最后将两个评分相乘,得到0分为-；1～3分为+；4分为++；>5分为+++。在本研究中将“-”定义为阴性,“+”定义为轻度阳性,“2+”定义为中度阳性,“+++”定义为强阳性。3.统计学分析通过SPSS13.0分析软件,应用Spearman秩相关、非参数检验中的Kruskal-Wallis检验及Mann-Whitney检验,进行ABCG2表达水平与临床病理变量间的分析。应用Kaplan-Meier方法进行单因素的生存分析,log-rank检验分别用于大肠癌细胞的细胞膜和细胞浆的ABCG2表达情况的这两个分组的组内ABCG2不同表达程度的总体生存率的比较。将单因素生存分析中有统计学意义的变量,纳入Cox’s回归模型进行多因素的生存分析。P值<0.05认为有统计学意义。结果1。ABCG2免疫组化及统计分析50%的癌旁正常组织在肠壁的顶膜上有着ABCG2强阳性的细胞膜表达。在部分大肠癌标本的结缔组织和癌组织之间的区域的小血管壁有着ABCG2的强阳性的表达。总体上说,ABCG2在大肠癌组织的细胞浆中有着普遍的表达,83.1%的阳性表达率,其中13.3%是强阳性的表达。大肠癌细胞胞浆中ABCG2表达水平与大肠癌Dukes分期呈正相关(P=0.039),与其他的临床病理变量没有显著的相关性。在66.2%的大肠癌组织的细胞膜上有着ABCG2的表达,15.6%的大肠癌组织的细胞膜上呈现ABCG2的强表达。ABCG2在细胞膜上的表达水平,与大肠癌高的肿瘤分期(Dukes) (P<0.0001)、淋巴结(P<0.0001)和远处转移(P<0.0001)相关。2。生存分析225例病例中,有69例(30.7%)随访了60个月。细胞浆和细胞膜强阳性表达病例组的平均生存时间较其他病例组的生存时间要短(p<0.0001,P=0.001)。在单因素生存分析中,其他的预后因素有Dukes分期,淋巴结转移情况及是否有远处组织的转移。在多因素生存分析中,细胞膜的ABCG2的强阳性的表达是大肠癌预后的独立因素(P=0.038),相对危险度是2.439(可信区间,1.053-5.650)。在多因素生存分析中,远处组织的转移也是大肠癌预后的独立预后因素。强阳性的细胞浆的表达在多因素生存分析中并不是大肠癌独立的预后因素。结论ABCG2在大肠癌组织中有着明显的表达。ABCG2在大肠癌组织的细胞膜上的强阳性表达,与大肠癌高的肿瘤分期(Dukes)、淋巴结转移、远处转移及不良预后相关。单因素和多因素生存分析皆表明ABCG2细胞膜的表达是大肠癌总体生存率的独立预后因素,并且提示其在大肠癌的进展过程中可能起着作用。