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桦褐孔菌(Inonotus obliquus)又称白桦茸,主要分布于东欧、俄罗斯和北美部分地区,我国黑龙江、吉林等地也有分布。其菌核用于治疗癌症、心脏病及糖尿病等。桦褐孔菌醇是其主要的活性成分之一。该物质是一种羊毛脂烷型的三萜类化合物,有抑制移植肿瘤的活性,并且对体外的肺癌、胃癌等多种癌细胞也有一定的抑制作用。目前市场上很少有商品化的高纯度标准品,这不仅限制了对其进一步的药理和药效学研究,也使得对已有的桦褐孔菌醇产品的质量分析产生困难。因此,本研究采用高效、快捷、符合制药工艺要求的制备HPLC法进行了高纯度的桦褐孔菌醇制备。原材料桦褐孔菌菌核用95%的乙醇常温渗漉提取,得到28g乙醇提取物。提取物再分别用1050mL石油醚、2050mL乙酸乙酯依次萃取,乙酸乙酯萃取物用硅胶柱(2.6cm×30cm)粗分离,氯仿:甲醇=10:90洗脱去除极性杂质,再过C18柱层析(1cm×1cm)甲醇洗脱,吸附非极性杂质,得到HPLC制备前样品(3.37g),检测桦褐孔菌醇含量约为15%。制备分离条件研究用分析型色谱柱(Hypersil GOLD,C18 反相柱,250×4.6mm,5μm,)进行,测试了 75%的乙腈,70%-90%的甲醇-水溶液对桦褐孔菌醇及杂质的分离效果;测试了流速(0.6-1.OmL/min)、进样体积(20-1100μL)对制备分离的影响作用。在权衡上样量和纯度后,选取90%的甲醇为流动相,0.8mL/min的流速的条件进行线性放大计算,在到制备型色谱柱中(SinoChromODS-BP,15μm,300mm×40.0mm),以流速为 32mL/min、进样量为4mL进行分离,收集保留时间为40-45min的馏分160mL。得到含桦褐孔菌醇纯度为57.09%的样品。该馏分再次进制备柱进行再次分离,分别用蒸发光散射检测器(漂移管温度32℃,气体流量0.5mL/min)和光电二极管阵列检测器(190-360nm)检测,纯度分别为99%和97%。制备得到的桦褐孔菌醇用高、低分辨ESI质谱、1H-NMR、13C-NMR进行鉴定和表征。低分辨质谱测得该分离物的分子离子峰m/z为425.4(M+H-H2O)、407.4(M+H-2H2O)和443.3(M+H);低分辨质谱中m/z为425.4的分子离子峰用高分辨质谱进行分析确认得到的m/z为425.3772(M+H-H2O),经过数据库比对得到该结构为C30H49O,与桦褐孔菌醇的分子式一致。1H-NMR(500MHz CDC13)在高场区可见四环三萜类化合物典型的五个角甲基尖峰δ0.75(3H,s)、0.81(3H,s)、0.87(3H,s)、0.98(3H,s)和 1.00(3H,s),13C-NMR(500MHzCDCl3)、DEPT和COSY结果显示的碳原子的个数与化学位移均与已报导的桦褐孔菌醇相符,因此,确认为制备得到的为桦褐孔菌醇。本研究用制备HPLC获得了高纯度的桦褐孔菌醇,可为桦褐孔菌相关产品质量分析和检测提供标准品,并为进一步工业化制备桦褐孔菌醇提供了理论和实验基础。