论文部分内容阅读
1缺血性脑卒中后神经炎症反应和认知功能障碍之间的相关性目的:探究缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke,CIS)后小胶质细胞激活的神经炎症反应和认知功能障碍之间是否存在相关性。方法:采用成年雄性C57BL/6J小鼠,线栓法构建大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。TTC染色观察脑组织梗死、尼式染色观察脑组织体积萎缩、TUNEL染色观察细胞凋亡。腹腔注射溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,Brd U)后,经心脏灌流多聚甲醛溶液制备脑组织石蜡切片,免疫荧光检测Iba1、GFAP、Neu N和Brd U的表达;蛋白芯片检测炎性细胞因子的表达。旷场实验评估小鼠的自主探索行为;Morris水迷宫实验评估小鼠的空间学习和记忆功能;在CIS后动态观测小鼠生存率、体重和躯体感觉功能;结果:MCAO组小鼠的生存率为56.5%,右侧脑组织出现显著的梗死、体积萎缩和细胞凋亡;与Sham组相比,MCAO组小鼠减少NeuN+海马神经元和增加Iba-1+小胶质细胞,同时显著增加梗死同侧脑组织内炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ、IL-6、和TNF-α等的表达。行为学结果显示,与Sham组相比,MCAO组小鼠显著减少旷场内的运动总距离和中心区域停留时间;在水迷宫的空间学习阶段,MCAO组小鼠增加逃逸总时间/总距离;在空间记忆阶段,MCAO组降低在目标象限的停留时间和隐藏平台的穿梭次数;MCAO组小鼠增加墙角实验的右转率和神经功能评分。结论:在MCAO模型中,CIS后激活的小胶质细胞促进炎性细胞因子的释放与海马区神经元的死亡,伴随海马依赖性认知功能障碍的发生。CIS后恢复期小胶质细胞激活神经炎症反应和认知功能障碍之间存在正相关性。2 CX3CL1/CX3CR1信号轴参与神经炎症反应和认知功能障碍的调节作用目的:确定CIS后CX3CL1和CX3CR1的时间表达趋势,以及特异性调节CX3CL1/CX3CR1信号是否具有抑制神经炎症反应和改善认知功能障碍的作用。方法:采用成年雄性野生型(WT)、CX3CR1基因敲除纯合子(CX3CR1-/-)和CX3CR1基因敲除杂合子(CX3CR1+/-)C57BL/6J小鼠,构建MCAO模型。其中,MCAO+WT组小鼠在CIS后1、3和5天通过侧脑室注射重组CX3CL1蛋白(rCX3CL1)或者溶剂对照(PBS)。凝胶琼脂糖电泳鉴定基因型;Western blotting检测CX3CL1和CX3CR1蛋白表达。免疫荧光检测CX3CR1-GFP、CX3CL1和Iba1、GFAP、Neu N、Nestin蛋白的共定位。免疫荧光检测海马组织Iba1和CD68、Neu N和Brdu的表达;[18F]-FDPA/PET检测小胶质细胞激活的神经炎症反应;蛋白质芯片检测炎症细胞因子的表达。旷场实验评估小鼠的自主探索行为;Morris水迷宫实验评估小鼠的空间学习和记忆功能;CIS后动态观测小鼠生存率、体重和躯体感觉神经功能。结果:与Sham组相比,MCAO组梗死同侧脑组织内CX3CL1信号蛋白呈持续下降的表达趋势和CX3CR1信号蛋白呈先降后升的表达趋势。与MCAO+CX3CR1+/-组相比,MCAO+CX3CR1-/-组和MCAO+rCX3CL1组显著增加NeuN+海马神经元和减少CD68+/Iba1+的小胶质细胞、抑制神经炎症反应和减少炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ、IL-6和TNF-α的表达、在旷场实验中显著增加运动总距离和中心区域停留时间、在Morris水迷宫实验的学习阶段减少逃逸总时间/总距离、在空间记忆阶段增加目标象限停留的时间和隐藏平台的穿梭次数。结论:在MCAO模型中,特异性调节CX3CL1/CX3CR1信号能够抑制小胶质细胞的吞噬活性和释放炎症相关细胞因子,减少细胞凋亡和促进海马区神经元的存活,进而促进恢复期海马依赖性认知功能改善。3 CX3CL1/CX3CR1信号轴调控小胶质细胞激活神经炎症反应的分子机制目的:探讨特异性调节CX3CL1/CX3CR1信号抑制CIS后小胶质细胞激活神经炎症反应的分子生物学机制。方法:采用成年雄性WT型、CX3CR1-/-型和CX3CR1+/-型C57BL/6J小鼠,构建MCAO模型,侧脑室注射r CX3CL1或者PBS。采用BV2小胶质细胞系构建氧糖剥离和再复氧(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R)模型,同时,BV2细胞提前给予r CX3CL1或PBS干预。Western blotting检测IL-1β、IL-18、NF-κB P65、p-P65、Caspas1/cleave-caspas 1、GSDMD/GSDMDN-terminal的蛋白表达;免疫荧光检测Iba1和GSDMD蛋白共表达;ELISA检测细胞因子IL-1β/IL-18的表达。结果:与Sham组相比,MCAO+CX3CR1+/-组显著增加Iba1+/GSDMD+双阳性细胞数、增加IL-1β、IL-18、p-P65、cleave-caspase1和GSDMDN-terminal的蛋白表达。与MCAO+CX3CR1+/-组相比,MCAO+CX3CR1-/-组和MCAO+r CX3CL1组显著抑制IL-1β、IL-18、p-P65、cleave-caspase 1和GSDMDN-terminal的表达和减少Iba1+/GSDMD+双阳性细胞数。与OGD/R+PBS组相比较,OGD/R+r CX3CL1组明显减少细胞外IL-1β/IL-18的蛋白含量、抑制细胞内IL-1β、IL-18、p-P65、cleave-caspase 1和GSDMDNterminal的蛋白表达和Iba1+/GSDMD+双阳性细胞数。结论:在CIS后,CX3CL1/CX3CR1信号轴可通过小胶质细胞内NF-κB P65/Caspase1/GSDMD信号通路,减少细胞因子IL-1β/IL-18的表达和释放,从而对小胶质细胞激活的神经炎症反应具有重要的调控作用。