论文部分内容阅读
鸡γ干扰素(Chicken interferon-gamma,ChIFN-γ)作为一种细胞因子,不仅具有广谱的高抗病毒活性,还起着抗细菌与抗寄生虫的作用,ChIFN-γ的抗病毒和免疫调节机制在动物体内已比较清楚。实验室前期研究发现ChIFN-γ能显著提高烟草的抗虫性。转ChIFN-γ烟草的腺毛密度增加了一倍,腺毛分泌物较野生烟草明显增多,推测这些性状提高了烟草抗虫性。通过检测转ChIFN-γ烟草和野生型烟草的全基因组差异表达谱,结合GO与KEGG Pathway分析筛选出7个抗虫候选基因,进行荧光定量PCR验证最终获得3个可能与烟草腺毛发育相关的基因:CyP71、LBM1和IspH。本研究主要以3个基因的功能为重点,通过基因克隆、遗传转化拟南芥进行基因过表达研究,研究结果如下:通过提取烟草根和叶总RNA,一步法RT-PCR克隆了CyP71、LBM1和IspH。其中CyP71序列全长1545 bp,开放阅读框1545 bp,编码514个氨基酸,以亮氨酸含量最高(11.9%),生物信息学推测蛋白质性质:分子量为58.11 kDa,pI为8.49,蛋白质不稳定系数为38.04,属于稳定蛋白质,无信号肽和跨膜结构域存在。已登录到NCBI的其他物种的CyP71基因中,与马铃薯(Solanum tuberosum)的同源性达最高,达88%以上,系聚类分析表明CyP71在进化过程中相对保守。LBM1序列全长846 bp,开放阅读框846 bp,编码281个氨基酸,丝氨酸含量最高(9.6%),推测蛋白质性质:分子量31.98 kDa,pI为5.08,蛋白质不稳定系数48.07,属于不稳定蛋白,未匹配到信号肽和跨膜结构域。蛋白质结构域分析发现LBM属于MYB类转录因子并存在一个蛋白-蛋白互作的SANT DNA结合的结构域。IspH序列长1386 bp,开放阅读框1386 bp,编码461个氨基酸,谷氨酸和赖氨酸含量最高分别为8.7%和8.5%,分子量51.66 kDa,预测pI为5.59,蛋白质稳定系数29.02,属于稳定蛋白,推测存在线粒体和叶绿体的靶向信号肽。氨基酸序列在茄科植物中高度保守,与马铃薯和番茄的同源性都在92%以上,蛋白质结构域分析结果表明IspH属于Lyt B超家族,这类家族蛋白负责催化MEP途径的最后一步反应。构建含植物过表达载体pSH737-IspH、pSH737-CyP71和pSH737-LBM的农杆菌LBA4404,通过蘸花法遗传转化拟南芥,果荚成熟后收集种子进行筛选,得到CyP71抗性植株38株,LBM1 35株,IspH 30株,3个基因的转化率均在5%以上,其中对IspH抗性植株随机抽取10株进行GUS染色和基因组PCR验证,结果均为阳性。转IspH植株长势较同时期的野生型稍好,叶片颜色较深,GUS染色结果显示,转IspH拟南芥叶片所有的表皮毛细胞GUS报告基因都能被启动表达。体视显微镜下观测,表皮毛细胞均呈蓝色,表明IspH基因与表皮毛的发育直接相关。转IspH拟南芥表皮毛与野生型的大小和分布无显著差异,但数量较多。统计分析发现,25 mm2叶片面积内,转IspH拟南芥表皮毛数量平均为19.6,野生型平均为9.6,转IspH表皮毛数量增加了一倍以上,说明IspH基因的表达与拟南芥表皮毛的发育呈正相关。LBM1与CyP71抗性植株还处于幼苗阶段,该时期下其表皮毛较野生型拟南芥无显著差异,具体的调控作用还待进一步观察。研究为阐释ChIFN-γ调控烟草腺毛发育的作用机制奠定了基础。