论文部分内容阅读
新疆野生樱桃李(Prunus sogdiana)为国家二级保护植物,是一种仅分布于我国天山山脉的珍贵野生果树,其容易扦插繁殖并具有较强的抗逆性,作为砧木具有广泛的应用前景。植物根结线虫病是一种对生产危害严重的土传性病害,其中南方根结线虫(Meloidogyne incognita)对桃树的危害尤为严重,是目前桃产业中的主要问题。而新疆野生樱桃李与桃等多种核果类果树具有亲和性,因此选育抗根结线虫的单株作为砧木并进行推广对防治根结线虫病害具有重要意义。绝大多数植物的抗病是通过抗病基因(R基因)启动的,但植物特别是木本果树植物的根结线虫抗病分子机制目前并不清楚。本实验室利用新疆野生樱桃李实生群体,经过多年抗病性鉴定发现其中存在对南方根结线虫高度抗病和高度感病的单株,本研究对其中抗病基因进行了研究,主要结果如下:1、利用同源克隆法,从高度抗病的新疆野生樱桃李植株中扩增出一个具有NBS结构域的基因片段,经5’-和3’-RACE扩增获得其mRNA全长,命名为PsoRPM2(Prunus sogdiana RESIST PATHOGEN M.incognita 2),PsoRPM2蛋白属于TIR-NBS-LRR亚家族,抗病与感病植株中的蛋白氨基酸序列没有差异。在南方根结线虫入侵后,抗病樱桃李植株中的PsoRPM2基因表达明显提升,在取食位点建立过程中一直保持较高的表达量,而感病植株中的表达则逐渐降低。蛋白亚细胞定位实验表明PsoRPM2蛋白定位在细胞质和细胞核内。2、通过利用植物表达载体pCAMBIA1305.1,使用35S启动子驱动PsoRPM2基因并转入对南方根结线虫感病的烟草品种W38中,接种南方根结线虫45天后计算根结数/总根数、根结数/根鲜重、有根结根数/总根数、卵块数/总根数、卵块数/根鲜重、卵块数/根结数等6项抗病指标并进行统计分析,除卵块数/根结数一项指标以外,大部分转PsoRPM2基因株系在其余5项指标中都显著优于对照组(p<0.05),表明转基因烟草对南方根结线虫的抗病性获得了提高。3、通过TAIL-PCR方法,以PsoRPM2基因mRNA的5’-序列为模板,分别从抗病和感病新疆野生樱桃李植株中扩增出约2 000 bp的启动子序列。分析表明抗病植株的启动子元件TC-rich repeats的数目多于感病植株:经过启动子截短试验及点突变试验表明抗病植株中的启动子对水杨酸史加敏感,说明水杨酸可能参与了抵抗南方根结线虫的信号通路。4、利用抗病新疆野生樱桃李植株克隆得到PsoHSP90-1、PsoHSP90-2、PsoHSP83、PsoSGT1和PsoRAR1基因,通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术证实PsoRPM2蛋白可以与PsoHSP90-1和PsoSGT1蛋白互作,同时PsoHSP90-1自身能进行互作,并且PsoHSP90-1或PsoSGT1蛋白能与PsoRAR1蛋白进行互作,表明PsoRPM2蛋白在发挥抗病功能时需要与PsoHSP90-1和PsoSGT1等伴侣蛋白复合体共同参与完成抗病过程综上所述,新疆野生樱桃李中克隆得到的PsoRPM2基因能帮助转基因烟草抵抗南方根结线虫。该基因在抗病与感病植株接种南方根结线虫后的表达差异是由于启动子区水杨酸响应元件TC-richrepeats的数量差异所致。PsoRPM2蛋白可以与PsoHSP90-1和PsoSGT1伴侣蛋白复合体成员结合,共同参与植株抵抗根结线虫的过程。