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第一部分人垂体GH腺瘤中存在着cAMP-ERK1/2“交叉通讯”目的检测人垂体GH腺瘤中是否存在cAMP-ERK1/2“交叉通讯”,并研究gsp癌基因对肿瘤生物学行为的影响。方法收集人垂体GH腺瘤36例,应用PCR-DNA序列分析方法检测gsp癌基因的表达,采用免疫组化检测肿瘤组织中Ki67的表达,应用RT-PCR检测肿瘤组织中GH mRNA的表达水平,应用Western blot检测肿瘤组织中Ki67、ERK1/2、p-ERK1/2、GH的表达水平;体外细胞实验,对gsp癌基因阳性肿瘤细胞给予腺苷酸环化酶抑制剂Bithionol,对gsp癌基因阴性肿瘤细胞给予磷酸二醋酶抑制剂Rolipram,应用Western blot检测p-ERK1/2的表达水平。结果36例肿瘤中,gsp癌基因阳性发生率为36.1%(13/36);相较于gsp癌基因阴性组织,阳性肿瘤组织内p-ERK1/2、GH及Ki67的蛋白表达、Ki67阳性表达率、GH mRNA均明显增高(P<0.05);使用Bithionol干预后,gsp癌基因阳性肿瘤细胞p-ERK1/2表达明显下降(P<0.05),而使用Rolipram干预后,gsp癌基因阴性肿瘤细胞p-ERK1/2表达显著升高(P<0.05)。结论在垂体GH腺瘤中存在着cAMP-ERK1/2信号通路“交叉通讯”,gsp癌基因能够促进肿瘤的增殖活性,并对GH的调控产生影响。第二部分细胞内cAMP-ERK1/2“交叉通讯”调节垂体GH腺瘤增殖依赖于B-Raf和C-Raf目的研究cAMP-ERK1/2“交叉通讯”对人垂体GH腺瘤细胞及大鼠垂体瘤GH3细胞增殖的影响,并探讨B-Raf、C-Raf在其中的作用。方法首先应用CCK-8及EdU检测腺苷酸环化酶激动剂Forskolin对肿瘤原代细胞及GH3细胞增殖率的影响,应用Western bblot检测Forskliin对两种细胞p-ERK1/2、原代细胞中cyclinD1、GH3细胞中cyclinD3表达的影响。然后在两种细胞中应用不同浓度的B-Raf抑制剂SB590885及C-Raf抑制剂GW5074,另外在GH3细胞中转染特异性 B-Raf siRNA、C-Raf siRNA,检测分别抑制 B-Raf、C-Raf 后 Forskolin 对两种细胞增殖及相关蛋白表达的调控的变化。并利用免疫沉淀法检测Forskolin对B-Raf、C-Raf活性的影响。结果Forskolin促进了 GH腺瘤原代细胞及GH3细胞的增殖及p-ERK1/2的表达,并提高了原代细胞中cyclinD1及GH3细胞中cyclinD3的表达(P<0.01)。在两种细胞中,相应浓度的SB590885及GW5074均能减弱甚至消除Forskolin所诱导的增殖及相关蛋白表达的上调;在GH3细胞中,沉默B-Raf或C-Raf后消除了 Forskolin所诱导的增殖及相关蛋白表达的上调(P<0.01)。此外,在两种细胞中,Forskolin均能同时显著提高B-Raf及C-Raf的活性。结论在GH腺瘤中,cAMP-ERK1/2“交叉通讯”能够促进细胞的增殖,这种促增殖效应同时依赖于B-Raf和C-Raf。第三部分cAMP-ERK1/2“交叉通讯”通过活化CREB促进垂体GH腺瘤生长激素分泌目的研究cAMP-ERK1/2“交叉通讯”对人垂体GH腺瘤细胞及大鼠垂体瘤GH3细胞生长激素分泌的影响,并探讨CREB在其中的作用。方法首先检测腺苷酸环化酶激动剂Forskolin对肿瘤原代细胞及GH3细胞生长激素分泌的影响,应用Western blot检测Forskolin对两种细胞p-CREB表达的影响。然后在两种细胞中应用相应浓度的B-Raf抑制剂SB590885及C-Raf抑制剂GW5074,另外在GH3细胞中转染特异性B-Raf siRNA、C-Raf siRNA,检测分别抑制B-Raf、C-Raf后Forskolin对两种细胞生长激素分泌及p-CREB表达的调控的变化。并检测Forskolin对B-Raf、C-Raf’结合的影响。结果Forskolin促进了 GH腺瘤原代细胞及GH3细胞生长激素的分泌呈时间依赖性,能在短时间内促进p-CREB的表达。在两种细胞中,相应浓度的SB590885及GW5074均能显著减弱Forskolin所诱导的激素分泌及p-CREB表达的增加(户<0.01);在GH3细胞中,沉默B-Raf或C-Raf消除Forskolin所诱导的生长激素分泌及p-CREB表达的上调(P<0.01)。Forskolin不能促进B-Raf及C-Raf的结合。结论在GH腺瘤中,cAMP-ERK1/2“交叉通讯”能够促进细胞生长激素的分泌,这种促分泌效应依赖于CREB的磷酸化。