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心肌梗死的临床研究已余百年，虽已取得迅猛卓著进展，但其治疗仍是心血管医生面临的严峻挑战。经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是急性心梗再灌注治疗的主要措施，且安全有效。但冠脉再通后常会出现心肌缺血再灌注损伤（IschamicReperfusion Injury,IRI），临床表现为急性心肌梗死患者冠脉再通，梗死心肌再灌注后段时间，有的患者却出现心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死等系列病情反而恶化的表现，严重影响患者预后，成为目前阻碍急性心梗患者急诊再灌注治疗获益的主要难题。IRI是临床常见的病理生理过程，但其机制尚未完全阐明。研究认为，氧自由基增加、钙超载、心肌能量代谢异常、中性粒细胞激活、血管内皮细胞功能障碍等均参与了心肌IRI，并互为因果，最终导致心肌细胞凋亡和坏死。在心肌IRI中，细胞凋亡起到了重要作用，介导心肌IRI细胞凋亡的信号转导途径复杂多样，也是目前的研究热点之。深入了解心肌IRI及其致心肌细胞凋亡的分子生物学机制，阻断促发心肌IRI特别是细胞凋亡的信号转导通路，抑制心肌IRI，减少心肌细胞的缺失，改善心脏功能具有极其重要的临床意义。近年来研究证实肾素—血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)的激活参与心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程，心肌组织中血管紧张素II（Ang II）水平的升高加重了心肌缺血再灌注损伤，减少Ang II的生成或拮抗其作用对心肌有保护作用。肾素前体及其受体作为RAS系统的新成员，随着其逐渐在不同组织器官中均被发现而引起研究者重视。肾素（前体）受体(P)RR作为肾素及其前体的共同受体，于2002年首次被发现，(P)RR除了能激活肾素前体使其具有酶的活性外，还具有激活细胞内信号转导通路的作用。目前的研究已证实肾素（前体）与受体结合，激活ERK1/2、p38MAPK及PI3K/AKT等信号通路，造成血管内皮细胞、心肌细胞及肾脏系膜细胞损伤，在糖尿病肾病，高血压及其他心血管及肾脏疾病的病理生理过程中起到了重要的作用。但(P)RR在心肌IRI中的作用目前尚无人研究。本研究拟从细胞水平，应用H9c2胚胎大鼠心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation)损伤模型模拟在体IRI损伤，检测H9c2心肌细胞(P)RR的表达，应用siRNA干扰(P)RR及联合p38MAPK阻断剂，研究(P)RR介导的缺氧复氧所致H9c2心肌细胞凋亡及炎症反应的作用及信号转导机制。第一部分缺氧复氧导致肾素（前体）受体在H9c2胚胎大鼠心肌细胞中的表达变化目的：1.验证H9c2胚胎大鼠心肌细胞系中是否有(P)RR表达。2.检测siRNA干扰(P)RR效率。3.明确缺氧复氧所致(P)RR蛋白表达的变化，并进步确定使(P)RR蛋白表达最大的复氧时间。方法：1.H9c2细胞培养及传代。2.应用免疫细胞化学和免疫荧光方法检测H9c2细胞中(P)RR的表达，并结合RT-PCR半定量检测(P)RR mRNA的表达。3.检测siRNA干扰(P)RR的效率：设计三条siRNA引物siRNA653，siRNA132和siRNA965，采用real time PCR和Western blot法检测siRNA转染组及对照组中H9c2心肌细胞的干扰目的基因的mRNA和蛋白表达水平，以判断相应siRNA的抑制效能。4.缺氧复氧所致(P)RR蛋白表达变化的检测。实验分组：正常氧对照组（Normoxia），缺氧2小时组（2H），缺氧2小时复氧2小时组（2H/2R），缺氧2小时复氧3小时组（2H/3R），缺氧2小时复氧6小时组（2H/6R），缺氧2小时复氧12小时组（2H/12R）。应用Western blot方法测定(P)RR蛋白表达变化。结果：1.(P)RR在H9c2胚胎大鼠心肌细胞中的表达：免疫细胞化学结果显示H9c2胚胎大鼠心肌细胞呈长梭形。免疫荧光结果显示：细胞中(P)RR表达为绿色荧光标记，(P)RR蛋白主要分布在H9c2细胞的细胞膜、胞浆和细胞核膜。RT-PCR结果显示H9c2细胞中有(P)RR基因表达特异性条带出现，分子量为275bp。2.(P)RR干扰效率的检测结果：三种siRNA干扰均可显著减少(P)RR mRNA和蛋白表达水平，后续实验选择抑制效果最显著的siRNA965。3.缺氧复氧致(P)RR蛋白表达的变化：与Normoxia组比较，2H组(P)RR蛋白表达明显上调，2H/3R组较2H组无显著变化，2H/6R组(P)RR蛋白表达进步显著上调，2H/12R组(P)RR蛋白表达较2H/6R组有所降低。故提示2H/6R组(P)RR蛋白表达量达峰。后续实验复氧时间为6小时。结论：1、(P)RR存在于H9c2胚胎大鼠心肌细胞中。2、siRNA干扰可有效的抑制(P)RR mRNA和蛋白表达水平。3、缺氧复氧可致H9c2细胞(P)RR蛋白表达显著增高，2H/6R组蛋白表达达峰。第二部分缺氧复氧所致H9c2胚胎大鼠心肌细胞凋亡及炎症反应目的：检测缺氧2小时及再复氧6小时，H9c2心肌细胞凋亡及炎症因子表达的变化。方法：1.实验分组：正常氧对照组(Normoxia组)，缺氧2小时组（2H组），缺氧2小时再复氧6小时组（2H/6R组）。2.利用Annexin V-FITC/PI双染法，通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率。3. Western blot方法检测Caspase-3蛋白表达量。4.应用ELISA方法检测H9c2心肌细胞上清液中炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β的浓度。结果：1.细胞凋亡检测结果显示：H9c2细胞经历缺氧2小时的凋亡率为31.98%，较Normoxia组显著增加；2H/6R组的凋亡率为40.21%，较2H组进步显著增加。2. Western blot结果显示：与Normoxia组相比，2H组凋亡因子Caspase-3相对蛋白表达量显著增高，2H/6R组Caspase-3蛋白表达进步显著上调。3. ELISA方法结果显示：与Normoxia组相比，2H组细胞上清液炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β的浓度均显著上调，2H/6R组炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β的浓度进步显著上调。结论：1.缺氧2小时，H9c2心肌细胞凋亡率及Caspase-3蛋白表达显著增加，再复氧6小时上述凋亡指标进步增加。2.缺氧2小时，H9c2心肌细胞分泌炎症因子TNF-a，IL-6和TGF-β明显增加，再复氧6小时炎症因子分泌进步增加。第三部分肾素（前体）受体介导的H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的信号转导机制目的：利用siRNA干扰及联合p38MAPK抑制剂，从p38MAPK途径初步探讨(P)RR介导的缺氧复氧所致H9c2心肌细胞凋亡及炎症反应的信号转导机制。方法：1.实验分组：根据缺氧复氧干预分组：正常氧对照组（Normoxia）；缺氧2小时组（2H）；缺氧2小时复氧6小时组（2H/6R）。根据阻断(P)RR及其信号通路分组：对照组(Control)；siRNA干扰(P)RR组，即siRNA(+)组；只加入lipo2000的siRNA阴性对照组，即siRNA(-)组；加入P38阻断剂组SB203580，即SB203580组；加入lipo2000和SB203580组，即siRNA(-)+SB203580组；siRNA干扰(P)RR同时加入SB203580组，即siRNA(+)+SB203580组。2. Western blot方法检测p-p38及Caspase-3蛋白表达量。3.应用ELISA方法检测H9c2心肌细胞上清液中炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β的浓度。结果：1. Western blot结果显示：siRNA干扰(P)RR或加用p38MAPK抑制剂SB203580均可使p-p38蛋白表达下调；siRNA干扰(P)RR联合p38阻断剂SB203580使p-p38蛋白表达进步下调，提示p38MAPK活化至少部分通过(P)RR介导。2.缺氧复氧致p38MAPK磷酸化水平增加,siRNA干扰(P)RR单独或联用p38阻断剂SB203580可部分抑制缺氧复氧所致的p-p38MAPK的蛋白表达的上调。3. siRNA干扰(P)RR单独或合并阻断p-p38MAPK使Caspase-3蛋白表达下调。4. siRNA干扰(P)RR单独或合并阻断p-p38MAPK使炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β分泌减少。结论：(P)RR通过激活p38MAPK信号通路部分介导缺氧复氧致H9c2心肌细胞凋亡及炎症反应。