论文部分内容阅读
酶固定化技术使酶分子与载体材料多点连接,可有效避免酶变形及自溶现象,从而显著提高稳定性。采用复合载体进行双酶固定化不仅能弥补单一载体的不足,还能利用双酶的优势提高酶解效率。为了研究固定化双蛋白酶制备活性肽技术,提高酶解效率,本文对复合载体固定化双蛋白酶(Double proteases immobilized within alginate-chitosan,ACDP)和双蛋白酶聚集体(Crosslinked enzyme aggregates,CLEAs)的性质和应用进行了系列研究。首先,在复合载体固定化双酶(ACDP)制备玉米活性肽(Corn Peptides,CPs)方面,研究了利用碱性蛋白酶和胰蛋白酶,以海藻酸钠-壳聚糖为复合载体,以玉米醇溶蛋白(zein)为底物制备玉米活性肽CPs。探究了传统方法与ACDP方法对zein的降解效果,确定了ACDP的最佳制备工艺,对zein降解水解度比传统方法更高;对酶解物玉米粗肽进行了分离纯化得到五个不同分子量分布范围的CPs组分(F1:>6 kDa,F2:4 kDa-6 k Da,F3:<4 kDa,CPs-1,CPs-2),对五种CPs组分进行抗氧化活性及降血压活性分析,结果表明分子量范围分布越小,抗氧化及降血压活性越好。活性肽组分CPs-1和CPs-2的DPPH自由基清除活性的IC50分别为0.47和0.23 mg/mL;CPs-2具有79.34%的体外降血压活性,灌胃10mg/kg的CPs-2的SHRs 12 h后SBP下降44.6 mm Hg,DBP下降10.2 mm Hg。因此,利用海藻酸钠-壳聚糖复合载体固定化双酶技术可制备具有良好生物活性的玉米肽。其次,在交联双蛋白酶聚集体(CLEAs)方面,本文将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在沉淀剂乙醇的作用下沉淀,并采用戊二醛进一步将双蛋白酶进行交联,制备得到中性蛋白酶-木瓜蛋白酶聚集体。确定了最佳沉淀剂乙醇,双酶液/戊二醛为1/5,最佳交联时间为4 h,所得酶聚集体较游离态蛋白酶稳定性高,适用于水溶性黄豆、绿豆、红豆和黑豆蛋白及醇溶性玉米蛋白的酶解应用,且其对五种蛋白的水解度(7.79%、12.01%、10.22%、9.04%和5.18%)比对应游离态酶的水解度(7.25%、7.53%、6.18%、7.17%和1.89%)显著提高(P<0.05)。由此可见,利用酶聚集体的形式固定化双蛋白酶可得到稳定性较高的固定化双酶,为后续固定化酶的应用奠定了基础。