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背景:GFI1作为一个锌指蛋白,在许多造血、淋巴和髓系祖细胞以及成熟淋巴和髓细胞中广泛表达,起转录抑制因子作用。C端锌指结构域介导其与DNA的相互作用,N端SNAIL/GFI-1(SNAG)结构域则帮助其行使抑制作用。在内皮细胞向造血细胞转化过程中,GFI1能够帮助细胞脱离原始基质。GFI1与多种血液系统疾病相关,包括嗜中性白血球减少症和白血病。GFI1在胚胎晚期周围神经系统的发育中起着重要的作用,主要调控内耳毛细胞、视网膜神经细胞、肺神经内分泌细胞的发育。最近发现GFI1与MYC协同作用,促进髓母细胞瘤的形成。GFI1在淋巴造血系统最早期的发育中发挥重要作用,其表达于造血干细胞中,能够调控造血干细胞的自我更新。我们首次发现GFI1在肺癌细胞中广泛异位表达。进而对其在肺癌发生发展中发挥的具体功能和禁止进行了进一步的探究。目的:明确GFI1在肺癌病人组织以及肺癌细胞系中表达特点;阐明GFI1在肺癌细胞系中异位表达所发挥的功能,以及其行使其功能的具体机制;探讨GFI1在肺癌细胞中异位表达的表观遗传学机制;判断其是否有可能成为肺癌早期诊疗、预后的标记物以及治疗的靶点。方法:1.用PCR、western检测GFI1在不同肺癌细胞系中表达的差异,用免疫组化的方法检测GFI1在不同类型的肺癌组织中表达的差异,探究GFI1在不同类型的肺癌细胞系以及病理组织中的表达特点,明确GFI1与肺癌进展的关系。2.通过鼠尾静脉注射将过表达GFI1的人类肺癌细胞系注入BALB/C裸鼠体内,观察得出小鼠的生存曲线,研究在动物体内GFI1在肿瘤形成过程中所发挥的功能。3.利用Microarray检测A549过表达GFI1相对于对照组转录谱的变化,并利用实时定量PCR进行验证。4.在表达GFI1较低的肺癌细胞系中过表达该基因,而在表达量高的细胞系中敲低其表达,进行一系列细胞行为学方面的实验,包括划痕实验、增殖实验、侵袭实验、失巢凋亡检测、体外成瘤实验,明确GFI1的表达具体作用于肿瘤发生发展中的哪一具体环节。5.用western检测探究GFI1影响的下游通路,以及抑制下游通路后所发生的回复实验。6.利用Luciferase Assay、Ch IP技术明确GFI1的启动子区域,3C、DNA甲基研究GFI1表达的具体表观遗传机制。结果:1.GFI1与肺癌淋巴结远端转移以及不良预后相关。(1)造血系统特异性的转录因子GFI1在肺癌细胞系及病人组织中均有表达。并且淋巴结转移越高的病人中GFI1表达越高。GFI1表达高的病人生存时间明显缩短。(2)通过鼠尾静脉注射将过表达GFI1的A549注入BALB/C裸鼠体内,实验组小鼠生存时间明显变短。这说明,GFI1在动物体内能够帮助肿瘤的形成。2.GFI1的表达帮助细胞逃避失巢凋亡。(1)A549细胞中过表达GFI1后,细胞形态发生明显的改变,趋于变圆,细胞与与细胞之间,以及细胞与基质之间的粘附能力明显降低。而在高表达GFI1的H1155敲低GFI1的表达,细胞的粘附能力明显提高。(2)A549细胞中过表达GFI1进行Microarray分析显示细胞粘附相关通路被下调,实时定量PCR也能证明一系列整合素蛋白表达被下调。(3)HUVEC、HBEC、A549、H460细胞中过表达GFI1,细胞在低吸附的培养皿中存活能力显著增强。而悬浮状态的小细胞肺癌细胞系H209中敲低GFI1的表达,细胞的凋亡水平有所上升。而在接下来的通路研究当中,过表达GFI1能够促进Erk磷酸化水平的上升,加入Erk磷酸化抑制剂u0216能够使细胞抵抗失巢凋亡的能力发生一定回复。这些数据共同说明,GFI1能够通过激活Erk磷酸化来帮助细胞提高在脱离基质环境中的生存能力。3.GFI1基因结构上的相互作用导致GFI1在小细胞肺癌细胞系中表达的增高。(1)利用Ch IP研究组蛋白修饰与Luciferase报告基因技术共同验证,发现GFI1的第三个启动子活跃。(2)利用3C技术检测了A549、H209中GFI1的染色质空间高级构象的差异。H209中GFI1启动子区域形成明显的环状结构,而A549中则不存在这种结构。而Luciferase实验显示H209中第三个启动子位置与其上游1.5kb的位点形成环状结构。(3)DNA甲基化检测发现,在低表达GFI1的A549、H460细胞系中启动子区域甲基化水平明显较高,而高表达GFI1的H1155、H209中则很低。DNA甲基化有可能是调控GFI1的表达的机制之一。结论:GFI1在肺癌细胞中异位激活,而且与淋巴结转移密切相关。在GFI1功能的研究中我们发现,GFI1通过激活Erk磷酸化来帮助细胞逃避失巢凋亡,最终形成远端转移。而GFI1在小细胞肺癌细胞系中基因结构相互作用的形成屏蔽了上游沉默子对GFI1转录的抑制。启动子区甲基化水平也是调控GFI1转录的机制之一。我们的研究拓宽了对肺癌发生发展的认知,为进一步的临床研究与治疗提供了一定的理论依据。