癌症的发病率和死亡率逐年上升,近10年来增加更为明显。目前,癌症已经成为中国城市居民的首位死因和农村居民的第二位死因,严重地危害人类的健康。目前肿瘤的治疗手段主要有手术、化疗、放疗、生物治疗等多种治疗手段。肿瘤手术切除是目前临床首选治疗方法。然而,70%以上的肿瘤病人入院确诊时常由于肿瘤负荷较大,病人的身体状况或心肺等功能不能承受大的创伤性(开胸、开腹)手术,失去了根治手术治疗的机会。因而,以直接灭活肿瘤细胞消除肿瘤负荷为目的的微创局部消融治疗手段近年来引起了广泛的关注。局部消融治疗可以为失去常规手术根治性治疗机会的实体肿瘤患者提供新的治疗选择。在很多中晚期肿瘤患者中取得了较好的疗效。随着微创消融技术的开展,对于主要瘤体消融后的残余病灶及影像学难以显示的亚临床病灶的序贯治疗受到临床的广泛关注。临床治疗研究结果显示,局部肿瘤组织消融后,对残余病灶局部药物注射(如低浓度乙酸、低浓度氢氧化钠、高渗盐水、酒精、化疗药物等),可以加强局部治疗效果。但氩氦刀冷冻治疗和微波消融后对局部细胞免疫功能的影响及如何提高治疗后局部抗肿瘤免疫治疗作用,是近年来局部消融免疫研究的重点。CpG ODN是一个人工合成的强大免疫激活剂。它在肿瘤治疗中最具特征性的免疫活性是它能激活DC,使其活化、增殖、分化,增强对初始T细胞的激活,诱导多种细胞因子特别是IL-12和IFN-γ的产生,调节免疫应答向Th1型分化。此外,CpG ODN能诱导多克隆B细胞增殖；也能刺激NK细胞,使其产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子,产生免疫调节作用；也能激活T细胞,启动特异性抗肿瘤免疫应答。这些是其发挥抗肿瘤免疫的主要机制。本课题设计采用微波消融／氩氦刀冷冻治疗BALB/c小鼠皮下移植CT26结肠癌模型,在消融后1h瘤周注射TLR9激动剂-CpG ODN,观察这种联合治疗对荷瘤小鼠的治疗作用,以及对小鼠免疫状态的影响。第一部分TLR9激动剂-CpG ODN对于小鼠淋巴细胞的活化作用及对DC成熟的影响目的：检测CpG ODN对BABL/c小鼠脾来源淋巴细胞的活化作用及CpG ODN刺激后DC表面分子表达情况方法：分离小鼠脾中的淋巴细胞,使用不同浓度的CpG ODN刺激该淋巴细胞,流式细胞术检测CD69+CD4+T细胞、CD69+CD8+T细胞和CD69+CD19+B细胞所占的比率。从小鼠骨髓中分离出DC, CpG ODN刺激后,流式细胞仪检测DC表面表达的共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ分子的比率。结果：1.不同浓度的CpG ODN均能活化小鼠脾淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞,表现为CD69+CD4+T细胞、CD69+CD8+T细胞和CD69+CD19+B细胞水平较空白对照组中相应的细胞水平显著性增高(相应地F=10.501,F=16.570,F=1564.965,P均<0.001)。2. CpG OND刺激后的DC,流式细胞术检测其表面分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达均较未加刺激剂的DC明显增高(相应地,F=59.680,P<0.001；F=47.233,P<0.001；F=18.674,P=0.003),LPS促成熟的DC与CpG OND刺激后的DC的表面分子CD80, CD86和MHCⅡ的表达无显著性差异(P均>0.05)。第二部分微波消融／氩氦刀冷冻联合TLR9激动剂-CpG OND对小鼠CT26结肠癌的治疗作用目的：观察微波消融或氩氦刀冷冻联合CpG OND对小鼠结肠癌CT26的治疗效果。方法：实验选用BALB/c小鼠及小鼠结肠癌CT26细胞造模。造模成功的小鼠随机分成瘤周注射PBS组、瘤周注射CpG ODN组、微波消融组、微波消融联合CpG ODN组、氩氦刀冷冻组和氩氦刀冷冻联合CpG ODN组六组。观察小鼠肿瘤的生长趋势、计算小鼠的中位生存期、体积抑瘤率。观察微波消融组、微波消融联合CpG ODN组、氩氦刀冷冻组和氩氦刀冷冻联合CpG ODN组四组小鼠的肿瘤局部复发率。计算治愈小鼠针对CT26再挑战时的成瘤率。结果：1.微波消融治疗、微波消融联合CpG ODN、氩氦刀冷冻及氩氦刀冷冻联合CpG ODN这四种治疗对于小鼠控制肿瘤的生长都具有显著作用,能够完全消融掉皮下移植的肿瘤。与对照组(PBS组)相比,抑瘤率分别为97.64%、97.84%、96.22%、97.75%。与对照组相比,单纯瘤周注射CpG ODN对小鼠的控制肿瘤生长没有显著性作用。2.微波消融治疗组、微波消融联合CpG ODN组、氩氦刀冷冻组及氩氦刀冷冻联合CpG ODN组这四组小鼠的中位生存时间较对照组(PBS组)显著性延长(P=0.000),CpG ODN组与PBS组小鼠的中位生存时间无显著性差异(P=0.756)。3.微波消融治疗组小鼠的局部复发率为26.7%,而微波消融组联合CpGODN组的局部复发率为6.7%。但两组的局部复发率无显著性差异(P=0.330)。氩氦刀冷冻治疗组小鼠的局部复发率为33.3%,氩氦刀冷冻联合CpG ODN组肿瘤局部复发率为6.7%,两者有显著性差异(P=0.002)4.在肿瘤再攻击实验中,微波治疗组小鼠在肿瘤完全治愈后再次给予CT26细胞攻击时成瘤率为75.0%,微波联合CpG ODN组的成瘤率为25.0%。后者的成瘤数量少于前者,但两者相比无显著性差异(P=0.132)。氩氦刀治疗组小鼠的成瘤率为75.0%(6/8),联合治疗组治愈的小鼠成瘤率为12.5%(1/8),两者相比有显著性差异(P=0.041),后者成瘤率较前者低。第三部分微波消融／氩氦刀冷冻联合TLR9激动剂-CpG OND对荷瘤鼠免疫状态的影响目的：研究局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG OND对荷瘤鼠免疫状态的影响。方法：小鼠的处理分组与第二部分相同。小鼠行不同治疗后21天处死,利用流式细胞术检测小鼠外周血中CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞的比例。采用酶联免疫吸附试验检测小鼠外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ的含量。使用免疫组化法检测各种治疗后的小鼠肿瘤组织中CD3+T细胞、CD45R0阳性细胞的浸润情况及颗粒酶B、FasL蛋白的表达情况。结果：1.与对照组(PBS组)相比,无论是局部消融还是局部消融联合CpG ODN对荷瘤小鼠外周血中的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞的比例都没有显著性差异(相应地,F=0.768,P=0.588；P=2.447,P=0.057；P=2.040,P=0.136)。但局部氩氦刀冷冻和局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN治疗对CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞的比率有影响,治疗后小鼠外周血中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞的比率较对照组(PBS组)有显著性升高(相应地,P=0.019；P=0.007；P=0.002)。虽然微波消融组该比率与对照组的差异无显著性,但是其P=0.051。CpG ODN组与PBS组该细胞比率无显著性差异(P=0.921)。2.瘤周单次注射CpG ODN对荷瘤小鼠外周血中细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的水平无明显影响(相应地,P=0.581；P=0.445；P=0.799)。局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)及局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN后小鼠外周血中的IL-2、IL-12和IFN-γ的水平均较对照组升高(P均<0.05),而且局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN后小鼠外周血中IL-2、IL-12和IFN-γ的水平较单独局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)组高。3.免疫组化结果显示：局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)后小鼠肿瘤组织中CD3+T细胞的浸润较对照组显著升高(相应地,P微波=0.028,P氩氦刀=0.007),但仍较局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN低(P均<0.05),差异有显著性。局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN组肿瘤组织中CD45RO+细胞较其余四组显著性增高(P均<0.05)。其余四组之间无显著性差异(P=0.099)。微波消融／氩氦刀冷冻联合CpG ODN组的小鼠肿瘤局部颗粒酶B较单纯微波消融／氩氦刀冷冻组显著升高(P均<0.05)。氩氦刀冷冻联合CpG ODN组小鼠肿瘤局部CTL上FasL的表达水平较单纯微波消融／氩氦刀冷冻组显著升高(相应地,P=0.010；P=0.010)。本文结论：1. CpG ODN可以激活多种免疫细胞,促进小鼠脾淋巴细胞发生活化。可以上调小鼠骨髓来源的DC上CD80、CD86和MHCⅡ的表达率。2.与对照组(PBS组)相比,微波消融／氩氦刀冷冻及相应联合治疗组这四组小鼠的中位生存期明显延长,但这四组小鼠的中位生存期之间无显著差异。微波消融／氩氦刀冷冻及相应联合治疗对小鼠肿瘤体积的抑瘤非常显著,但四组之间无明显差异。3.氩氦刀冷冻治疗联合CpG ODN组的肿瘤局部复发率较单纯氩氦刀冷冻组显著降低；氩氦刀冷冻治疗联合CpG ODN组的成瘤率显著低于单纯的氩氦刀冷冻治疗。微波消融联合CpG ODN有降低小鼠肿瘤局部复发率和再次成瘤率的趋势。局部消融联合CpG ODN治疗组的小鼠肿瘤局部免疫活性细胞CD3+增多,局部免疫活性增强,可能与联合治疗组的局部复发率下降有关。肿瘤特异性记忆性细胞的增多可能是联合治疗组小鼠对于同样肿瘤细胞再次攻击时抵抗力提高的原因。说明局部消融联合CpG ODN能提高小鼠的免疫功能。4.微波消融／氩氦刀冷冻组及相应联合CpG ODN治疗组这四组小鼠外周血中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞的比率较对照组(PBS组)显著增高,然而该比率在这四组之间无显著差异；四组小鼠外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ水平增高,且微波消融／氩氦刀冷冻联合CpG ODN治疗组的小鼠外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ水平较单纯微波消融／氩氦刀冷冻组更高。这些细胞因子水平的增高可能与免疫细胞活性增强有关。