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目的药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是常见的药物不良反应。其中对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)过量是诱导肝损伤最常见的DILI。在我国,中药和中成药引起的肝损伤占很大比例,其中雷公藤多苷(Tripterygium glycosides,TG)引起的肝损伤已引起了广泛关注。氧化应激在APAP或TG诱导的肝损伤过程中起重要作用。APAP和TG诱导肝损伤中均显示有活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加,抗氧化防御水平降低。其中CYP2E1是引起氧化应激的主要原因。CYP2E1酶活性区域小,分子内作用力和分子间的范德华力能量较高,介导底物代谢时,酶与底物结合不稳定而易发生变构,易导致氧化应激而诱导肝损伤。CYP2E1可在多种肝脏疾病中被诱导。microRNA(miR)可参与多种肝脏病理生理学过程,其中miR-378a-3p可特异性的靶向CYP2E1而调节其基因表达。此外CYP2E1有遗传多态性,基因突变可影响其表达,并导致个体间药物代谢与毒性反应的差异。本研究旨在探讨1)CYP2E1在APAP或TG诱导的肝损伤中的作用以及APAP或TG对CYP2E1和miR-378a-3p表达的调节及其可能的调节机制;及2)CYP2E1基因突变对CYP2E1基因表达及对APAP或雷公藤甲素(Triptolide,TP,TG的主要活性及毒性成分)诱导肝损伤敏感性的影响。方法1.大鼠长期(4周)灌胃给予低、中、高剂量APAP或TG诱导肝损伤,同时选择中剂量APAP或TG与氯美噻唑(clomethiazole,CMZ)联合给药,收集血清和肝脏样本用于肝损伤指标检测及肝组织病理学检查。qRT-PCR和western blot检测各组大鼠肝脏中CYP2E1和miR-378a-3p基因表达水平。2.采用全基因合成方法合成野生型和突变型CYP2E1 cDNA,定向克隆至慢病毒表达质粒LV5,获得重组慢病毒表达质粒LV5-CYP2E1-1263C/wt和LV5-CYP2E1-1263T/mt。将重组慢病毒表达质粒或空载慢病毒质粒(LV5-NC)感染HepG2细胞,并根据实验分组将部分重组细胞分别用20mM APAP或200nM TP处理。收集细胞培养液及部分细胞分别用于ALT和GSH水平检测。qRT-PCR和 westernblot 检测 CYP2E1及miR-378a-3p 基因表达。3.采用基因转染技术将miR-378a-3p抑制剂或miR-378a-3p类似物瞬时转染LV5-CYP2E1重组HepG2细胞,并分别用20mM APAP或200nM TP处理。收集细胞培养液及部分细胞分别用于ALT和GSH水平检测。qRT-PCR和western blot检测CYP2E1、miR-378a-3p和Nrf1基因表达水平。结果1.大鼠连续四周给予APAP或TG后,血生化指标,肝氧化应激水平及TNF-Α水平明显上升,而抗氧化防御水平明显下降。H&E染色显示APAP和TG给药组大鼠出现不同程度的肝损伤肿胀,肝索紊乱,肝水样变性及炎症细胞浸润等。CMZ联合给药组可明显改善APAP或TG诱导的生化指标水平、肝氧化应激及抗氧化系统和TNF-Α水平变化,明显改善APAP或TG引起的肝组织病理学改变。APAP或TG给药可引起大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA和/或蛋白质表达明显升高。CMZ联合给药可明显降低APAP或TG诱导CYP2E1基因表达的升高。各给药组大鼠肝脏中miR-378a-3p表达水平均显著降低,且与血清ALT、AST水平及CYP2E1蛋白质表达水平呈显著负相关。2.LV5-CYP2E1-1263C/wt,LV5-CYP2E1-1263T/mt,LV5-NC 重组慢病毒的滴度分别为7×108 TU/ml,6×108 TU/ml,6×108 TU/ml。重组慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜可观察到绿色荧光表达。与CYP2E1-wt相比,CYP2E1-mt中的CYP2E1 mRNA和蛋白质表达水平均显著降低。3.APAP 处理后,CYP2E1 mRNA 在CYP2E1-wt 和 CYP2E1-mt 重组细胞中的表达均显著增加,CYP2E1蛋白质在CYP2E1-wt重组细胞中的表达显著降低,而在CYP2E1-mt重组细胞的表达无明显变化。APAP处理的重组细胞ALT均显著升高、GSH降低,且CYP2E1-mt重组细胞中ALT水平更高。TP处理后,CYP2E1-wt重组细胞中CYP2E1 mRNA表达显著降低,蛋白质表达显著增加;而CYP2E1-mt重组细胞中CYP2E1 mRNA和蛋白质表达均无显著差异。TP处理后,CYP2E1-wt重组细胞中ALT显著降低,而CYP2E1-mt重组细胞中ALT水平无显著变化。TP处理的重组细胞中GSH水平无明显变化。APAP 或 TP 处理后,CYP2E1-wt 和 CYP2E1-mt 重组细胞中 miR-378a-3p 表达水平明显增加。4.miR-378a-3pi可明显增加APAP对CYP2E1 mRNA表达的诱导作用,并可逆转APAP对CYP2E1蛋白质表达的抑制作用。miR-378a-3pm可进一步降低CYP2E1蛋白质的表达。当细胞中miR-378a-3p表达水平较低时,APAP对CYP2E1蛋白质表达几乎无调节作用。APAP处理后,Nrf1 mRNA表达明显上升,而蛋白质表达降低。APAP对细胞中ALT水平的释放不完全依赖于CYP2E1,而增加细胞中miR-378a-3p水平可显著降低APAP处理的细胞中的ALT水平,对APAP诱导的肝损伤有保护作用。miR-378a-3pi可明显逆转TP对CYP2E1 mRNA表达的下调和蛋白质表达的上调作用。miR-378a-3pm可显著降低TP处理的重组细胞中CYP2E1蛋白质表达水平。TP处理后,各组重组细胞中Nrf1 mRNA表达降低,而Nrf1蛋白质表达水平明显上升。经TP处理的重组细胞组中的ALT水平相对较低,表明TG(TP)诱导肝细胞ALT升高需要更长的时间。结论1.连续四周给予APAP或TG可引起大鼠肝脏氧化应激和组织损伤。APAP或TG长期给药可显著增加大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA和/或蛋白质的表达。CYP2E1抑制剂可明显降低APAP或TG诱导的肝损伤的指标和症状及CYP2E1基因表达水平,CYP2E1在APAP和TG诱导的肝损伤过程中起重要作用。2.连续四周给予APAP或TG后,大鼠肝脏中miR-378a-3p表达水平明显下降,且与肝损伤指标和CYP2E1蛋白质表达水平呈显著负相关。3.rs2515641突变可显著降低CYP2E1 mRNA和蛋白质的表达水平及APAP或TP对CYP2E1蛋白质表达调节的敏感性,并可影响APAP或TP处理后重组细胞中肝功能和抗氧化指标的变化。4.抑制细胞中miR-378a-3p表达水平可明显降低APAP或TP对CYP2E1基因表达的调节作用。APAP或TP对CYP2E1基因表达的调节过程需miR-378a-3p 的参与。miR-378a-3p 至少部分介导了 APAP 或 TP(TG)对 CYP2E1蛋白质表达的调节。APAP和TP可能通过对Nrf1和miR-378a-3p负反馈环的调节而调节miR-378a-3p的基因表达,进而调节CYP2E1基因表达。