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研究背景及目的:
前期研究证实，椎管内单次注射携带神经生长因子前导肽-β-内啡肽融合基因（NEP）的第一代腺病毒能够有效减轻神经病理性疼痛，但是持续表达的β-内啡肽是否会出现蓄积过量仍有疑虑，而且第一代腺病毒免疫原性高，β-内啡肽无法长期表达。因此，本实验中我们拟构建RU486可调控NEP基因的第一代腺病毒，并进行体外验证；同时试行构建RU486可调控NEP基因的第三代腺病毒载体。
方法:
1. 构建由RU486可调控NEP基因的腺病毒穿梭质粒pDC312-RUNEP，同时分别构建携带报告基因RFP或 LUC质粒pDC312-RURED与pDC312-RULUC，以及仅携带NEP的穿梭质粒pDC316-NEP；
2. 利用AdMAXTM 系统，重组得到第一代腺病毒Ad-RUNEP和Ad-NEP，进行扩增、纯化和测定滴度；
3. 穿梭质粒pDC312-RURED和pDC312-RULUC分别脂质体转染HEK293细胞，检测RU486调控系统的功能；
4. 腺病毒Ad-RUNEP感染NIH3T3 和A431，加入不同剂量梯度的RU486，两天后去除RU486诱导， ELISA定量检测加入RU486之后第1、2和4天每一样本培养上清中β-内啡肽的表达含量，使用Ad-NEP作对照；
5. 利用Gateway○R系统同源重组法，重组构建第三代腺病毒载体pGL-RUNEP；
6. 利用SPSS统计软件分析所得数据结果。
结果:
1. 得到滴度为2.25×1010PFU/ml的第一代腺病毒Ad-RUNEP；
2. RU486调控系统的检测： RFP和LUC的表达都会随RU486呈剂量依赖性增加；
3. ELISA定量检测：当RU486剂量达10-7mol/l时，β-内啡肽的表达也达到最大，并且随RU486的给药停止而减弱；
4. 成功构建得第三代腺病毒载体pGL-RUNEP。
结论:
我们已成功构建携带RU486可调控NEP基因的第一代腺病毒Ad-RUNEP，RU486对其β-内啡肽的表达起调控作用，并且RU486达10-7mol/l时，调控系统的诱导效能达到最大。另外，我们还成功构建了第三代腺病毒载体pGL-RUNEP，为今后空壳腺病毒GLAd-RUNEP的生产做好了充分的准备。