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目的：多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）患者RANKL表达异常增高使RANKL/RANK信号系统过度激活，导致破骨细胞（Osteoclast，OC）大量生成且功能亢进在骨髓瘤骨病（Myeloma bone disease，MBD）的发生、发展中起关键作用，因此抑制RANKL/RANK信号转导途径从而抑制OC的形成及其破骨功能是治疗MBD有效方法之一。我们先前的研究发现RANK蛋白上存在一个新基序：IVVY，介导了一条OC形成所必需的新信号转导途径。本研究的目的就是要利用这个全新的RANK基序，寻找和鉴定出与新基序IVVY相互作用而且介导破骨细胞生成的、目前尚未知的下游信号转导蛋白，以进一步揭示RANKL/RANK系统激活引起破骨细胞形成的细胞信号转导途径（signalingpathway）。那么，这一信号转导途径及其信号转导蛋白很大可能就是MBD等骨病的特异性治疗靶点，为研究和开发治疗MBD特异性靶向药物奠定基础。研究内容和方法：1.采用Gateway技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞cDNA文库并进行鉴定2.酵母双杂交实验扫库以筛选与IVVY相互作用的候选下游信号蛋白3.与IVVY相互作用的候选蛋白在破骨细胞中表达情况验证利用Western Blotting技术和激光共聚焦扫描显微镜检测相应蛋白表达的定量、定位及其动态分析。4. IVVY基序与筛选到的候选蛋白相互作用的验证分别利用酵母双杂交和免疫共沉淀（coimmunoprecipitation, coIP）实验在酵母细胞和哺乳细胞293T中验证上述筛选到的候选蛋白与诱饵蛋白Bait之间的相互作用；另外，将诱饵蛋白Bait上的IVVY基序突变成IVAF以形成突变体Bait，再重复上述酵母双杂交和coIP实验，来证明候选蛋白是经IVVY基序与RANK相互作用。5.与IVVY相互作用的候选蛋白介导破骨细胞生成的功能鉴定利用RNAi技术抑制巨噬细胞内这一候选蛋白的表达，以及siRNA解救技术抵消这一RNAi作用，观察这一蛋白被抑制后及解救后的巨噬细胞形成破骨细胞的能力和水平，从而考察这一蛋白是否具有介导破骨细胞形成的功能，从功能上进一步证实这一与IVVY基序相互作用的蛋白为介导破骨细胞形成的IVVY基序下游信号转导蛋白。6. RYBP介导破骨细胞形成的结构域和机制研究利用coIP、ChIP、siRNA及其解救技术来鉴定RYBP上介导破骨细胞形成的结合结构域和功能结构域，以及RYBP介导破骨细胞形成的表观遗传学机制。结果：1．成功构建了小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达型文库文库总滴度达到3.9×107，酶切分析24个克隆，23个（95.83%）克隆有肯定的基因插入片段，插入片段大小范围为0.2-5.6Kb，平均为2.27Kb，证实此BMMscDNA表达型文库质量高，达到标准文库的要求。2．酵母双杂交技术筛库，成功筛选出最具可能性的候选蛋白RYBP3轮酵母双杂交试验，筛得10个阳性克隆的质粒，经测序分析发现，其中有6个是相同的，其基因库编号（GB）是BC080287，编码Ring1和YY1结合蛋白（Ring1and YY1-binding protein，RYBP），其出现的几率最高，意味着它是可能性最大的候选蛋白。另外3个筛选到的蛋白为：编码ATP结合盒（ATP-binding cassette）、编码E2F转录因子（E2F transcription factor)和热休克蛋白8(heat shock protein8)的基因。而且，回头检查实验结果也发现，表达RYBP蛋白的阳性克隆出现也最快。3．RYBP在破骨细胞形成过程中的表达及变化情况在M-CSF和RANKL的刺激下，在骨髓巨噬细胞（BMMs）向破骨细胞分化过程中，Western Blotting检测细胞内RYBP的表达量变化不大，但激光共聚焦扫描发现RYBP出现一个“从细胞核移动到细胞膜再又回到细胞核”的细胞内转移过程，提示RYBP在破骨细胞形成过程中发生着变化，很可能与破骨细胞形成密切相关。4．酵母细胞内验证RYBP与RANK蛋白之间的相互作用表达候选蛋白RYBP的AD-RYBP质粒与BD-Bait质粒共转化AH109酵母进行双杂交实验，不仅出现阳性克隆再次验证这两种蛋白的相互作用，即使将AD-RYBP质粒较常规稀释1000倍，仍能检测到蛋白之间的相互作用。5．coIP实验验证了RYBP与RANK蛋白IVVY基序之间的相互作用RYBP与Bait蛋白之间有相互作用（有共沉淀），但与Bait蛋白突变体之间无相互作用（无共沉淀），说明RYBP蛋白是经过IVVY基序与Bait（或者RANK）蛋白相互作用。6．RYBP介导破骨细胞形成的功能验证siRNA成功地沉默小鼠BMMs细胞RYBP蛋白，而沉默了RYBP蛋白的BMMs细胞形成破骨细胞的能力明显降低，siRNA解救技术成功解救RYBP-siRNA对破骨细胞形成的抑制作用。7．鉴定出RYBP上介导破骨细胞形成的结合结构域，其功能结构域以及RYBP介导破骨细胞形成的表观遗传学机制研究仍在进行当中。结论：本研究在先前发现RANK蛋白上新基序IVVY的基础上，通过构建巨噬细胞的酵母表达cDNA文库，再利用酵母双杂交、免疫沉淀、免疫荧光、RNA干扰及其解救等技术筛选和鉴定出与新基序IVVY相互作用而且介导破骨细胞生成的下游信号转导蛋白——RYBP，并且进一步研究和鉴定RYBP介导破骨细胞形成的结构域和表观遗传学机制，以揭示了RANKL/RANK系统激活引起破骨细胞形成的细胞信号转导途径以及破骨细胞生成的生理机制，积极探索MBD新的治疗靶点。