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目的:探讨livin在脑胶质瘤组织的表达及意义,研究化疗药物替尼泊甙(VM-26)抑制U-251细胞的作用机制。研究livin在脑胶质瘤细胞侵袭转移和细胞凋亡中的作用及意义。材料与方法:收集2004年4月至2005年4月中南大学湘雅医院神经外科30例脑胶质瘤手术新鲜标本,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blot方法从mRNA和蛋白水平检测脑胶质瘤组织中Livina、β的表达与胶质瘤临床病理特征的相关性;选自中南大学湘雅医院神经外科2002年5月—2005年1月住院胶质瘤手术石蜡标本60例。采用免疫组织化学检测脑胶质瘤组织中Livin蛋白表达水平,并结合临床随访资料分析Livin蛋白表达水平与胶质瘤临床预后的相关性。采用体外细胞培养技术培养胶质瘤母细胞系U-251,予以化疗药物VM-26干预,运用MTT方法检测化疗药物对胶质瘤细胞的抑制率,评价胶质瘤对化疗药物的敏感性,进一步采用流式细胞仪检测干预前后细胞的凋亡率,初步探讨替尼泊甙(VM-26)干预胶质瘤母细胞系U-251的机制,进一步采用体外划痕愈合实验(Woundhealing assay)和侵袭小室实验(Transwell assay)验证VM-26干预胶质瘤母细胞系U-251后的侵袭运动能力。结果:在30例新鲜胶质瘤组织标本中,均可检测到Livin mRNA的表达。同时,胶质瘤组织中Livin mRNA的平均表达水平也明显高于正常脑组织(2.13±0.41 vs.0.67±0.13),其差异有统计学意义(p=0.008)。为了确认Livin mRNA的表达情况,我们采用Western blot方法检测了同一批样本中Livin蛋白的表达。结果显示:Livin蛋白的高于正常脑组织中的表达(2.45±0.610 vs 0.991±0.22),其差异具有统计学意义(P=0.001)。此外,Livin mRNA和Livin蛋白表达水平具有显著相关性(R=8.321,P=0.015)。Livin mRNA和蛋白的表达水平与胶质瘤细胞的分化程度、瘤周脑水肿(PTBE)、肿瘤的直径大小等密切相关,而与年龄、性别、肿瘤部位、病理类型等其他临床病理特征无明显相关。Livin蛋白阳性表达为棕黄色或棕褐色颗粒,绝大多数位于细胞浆内。在60例的胶质瘤组织中发现44例Livin蛋白阳性表达,阳性表达率为73.3%。其余16例胶质瘤组织中则未见Livin蛋白表达。结合临床病理资料分析发现livin的阳性表达和肿瘤直径大小、肿瘤细胞分化程度具有显著性差异(P＜0.05)。Livin阳性表达组和阴性表达组的术后复发转移率和生存时间两组之间均存在显著性差异:Livin阳性表达组的术后复发/转移率显高于Livin阴性表达组(P=0.011),中位生存时间(590天)也明显小于Livin阴性组(389天,P=0.024)。采用逐步回归法建立Cox模型,分别以P＜0.05及P＞0.10作为引入和剔除影响因素的筛选水平。所有检验均为双侧检验,以P＜0.05作为差异具有统学显著性意义的界值。结果发现:肿瘤大小、肿瘤分化和Livin表达水平是胶质瘤预后的独立影响因素。3ug/ml、10ug/ml、30ug/ml替尼泊甙(VM-26)作用12h、24h、48h、72h对U-251细胞均有抑制作用。在通过MTT比色法检测结果显示,细胞数随时间的延长和药物浓度的增加而明显抑制,即具有量效和时效依赖性。替尼泊甙(VM-26)对U-251细胞的IC50是12.23 ug/ml。不同浓度VM-26处理U-251细胞后最初仅见细胞折光度下降,24h后细胞增殖变缓,核缩小;72h后变化显著,细胞稀疏,以圆形或索形细胞为主,呈散在分布,较对照组细胞少,细胞汇合饱和密度降低,较少形成团状的细胞球体。流式细胞检测结果显示中效浓度替尼泊甙(VM-26)抑制U-251细胞表现出明显的G2/M期周期阻滞作用,24h达到53.6%,并且这种阻滞效应随着时间延长而增多,于72h达到61.59%,对照细胞早期也表现出程度相似的G2/M期阻滞,但S期显著增多(P＜0.01)。U-251细胞侵袭过人工基底膜后的细胞形态,经HE染色后的细胞形态保持完整,细胞核呈深红色,胞浆呈淡红色,而聚碳脂膜上8μm膜孔呈深黑色样圆点;穿过人工基底膜和聚碳脂膜的细胞在Boyden小室的背面散在不均匀分布。在高倍镜下计数两个细胞株侵袭过人工基底膜的平均细胞数分别为343.5±23.8和115.2±11.3个,比较两组细胞穿透人工基底膜平均细胞数的差异具有高度显著性(P＜0.001)。中效浓度替尼泊甙(VM-26)下调U-251细胞livin mRNA和蛋白表达水平后,细胞的划痕愈合能力下降:对照组划痕24小时后细胞基本上爬满划痕区域,达到划痕的愈合,而VM-26抑制的U-251细胞则只有少量细胞爬行划痕区域,仍然留有明显的划痕存在。结论:livin的表达水平上调与胶质瘤的复发转移及预后密切相关,提示livin可以作为反映胶质瘤预后的一种有价值的分子标志物。VM-26可能通过抑制livin表达上调而诱导U-251细胞凋亡抑制其增殖。