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第一部分RSV感染对OVA诱发哮喘小鼠的影响目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染对哮喘气道变应性炎症的干预效应,明确RSV可诱发哮喘急性加重的潜在机制。也为下一步制备哮喘急性加重小鼠模型提供理论与实践的依据。方法按照随机数字法,将4周龄BALB/c、鼠分为正常对照组、哮喘模型组、哮喘合并RSV感染组、哮喘合并假病毒感染组。哮喘组采用卵蛋白(OVA)致敏和激发的方法制作小鼠哮喘模型；哮喘合并RSV感染组,则在哮喘组的基础上对实验小鼠进行两次RSV感染：哮喘合并假病毒感染组用紫外灭活后的RSV代替具有感染活性的病毒来感染小鼠。最后一次激发24 h后,采用Buxco肺功能仪检测小鼠气道反应性；肺组织病理HE、PAS染色,并对肺组织RSV病毒负载量进行检测；利用血细胞计数仪对肺泡灌洗液(BALF)中浸润的炎症细胞进行分类与计数；体外分离各组小鼠的肺CD4-T淋巴细胞,利用RT-PCR法检测肺脏CD4-T淋巴细胞RORγ T与Foxp3等转录因子的表达水平；流式细胞术检测肺脏CD4-T淋巴细胞中Th17和Treg的细胞比例；ELISA法测定肺泡灌洗液中的IL-4、IL-5、IL-6、IL-17a、IL-10、IL-12和INF-γ等细胞因子的分泌水平。结果(1)与正常对照组比较：哮喘模型组气道反应性及气道炎症显著加重(P<0.05),IL-4、IL-5、IL-6和IL-17a等Th2与Th17型细胞因子分泌水平明显上调(P<0.05),符合哮喘气道变应性炎症的特征；(2)与哮喘组相比,哮喘合并RSV再次感染后,肺脏RSV病毒负载量显著增加(P<.05),气道高反应性显著增加(P<0.05),且气道炎症进一步加重,但差别无统计学意义(P>0.05)；且同哮喘组相比,哮喘小鼠合并RSV再次感染后,肺泡灌洗液中Th2型细胞因子分泌进一步增多；肺脏Th17细胞应答水平,包括其细胞数量比例、转录因子RORγ T的表达以及肺泡灌洗液中IL-6和IL-17a的分泌水平等也均进一步上调；(3)与哮喘组相比,哮喘小鼠合并RSV初次感染后,肺脏RSV病毒负载量显著增加(P<0.05),气道高反应性及气道炎症明显减轻(P<0.05),肺泡灌洗液中Th2型细胞因子分泌显著减少,且其肺脏Th17细胞的应答水平,包括细胞数量比例、转录因子RORγ T的表达及肺泡灌洗液中IL-17a的含量等也均显著下调(P<0.05),同时Treg细胞应答水平明显上调(P<0.05)。结论RSV感染对OVA诱发哮喘小鼠具有双向的干预作用。在哮喘发作的基础上,合并RSV再次感染,可诱发哮喘急性加重,且其炎症特征是以Th2、Th17为优势的变应性炎症；而哮喘合并RSV初次感染可导致哮喘减轻,其缓解机制可能与逆转病理性Th17/Treg应答失衡有关。因此通过OVA致敏、激发,RSV反复感染的方法制作哮喘急性加重小鼠模型是可行的。第二部分补肾益气方对RSV反复感染诱发哮喘急性加重小鼠炎症缓解的机制研究目的补肾益气方为临床证实有效的抗哮喘方药,其对中医辨证为肾阳虚、肾气虚、肺肾两虚或兼有痰热之证的哮喘及其急性加重等疾病有良好的疗效。但目前该方药具体防治哮喘的药理学机制不明。本实验利用补肾益气方干预RSV反复感染诱发哮喘急性加重小鼠,通过体内、外实验研究,以期证实该方药对哮喘急性加重具有治疗作用,并探讨其炎症缓解机制。方法按照随机数字法,将4周龄的BALB/c小鼠分为正常对照组、哮喘组、RSV诱发哮喘急性加重组、地塞米松组、补肾益气方(低、中、高剂量)组等。哮喘组采用OVA致敏和激发的方法制作小鼠哮喘模型；RSV诱发哮喘急性加重组,则在哮喘组的基础上对实验小鼠进行两次RSV感染；中药干预组与地塞米松组用同样方法制备哮喘急性加重小鼠模型,并采用相应药物灌胃给药,模型组用等量生理盐水代替药物灌胃。最后一次激发24 h后,采用Buxco肺功能仪检测小鼠气道反应性；肺组织病理HE、PAS染色并进行观察分析；对肺组织RSV病毒负载量进行检测；利用血细胞计数仪对肺泡灌洗液中浸润的炎症细胞进行分类与计数；ELISA法测定肺泡灌洗液中的IL-4、IL-5、 IL-6、IL-17a, IL-12和INF-γ等细胞因子以及血清与肺泡灌洗液中的特异性IgE的分泌水平；体外分离各组小鼠的肺脏CD4+T淋巴细胞与巨噬细胞,利用RT-PCR法检测CD4+T淋巴细胞GATA3、T-bet、STAT6、RORγ T等转录因子及巨噬细胞CD80、CD86、 MHC-Ⅱ及Clec4e等共刺激分子或活化标志分子mRNA的表达水平；体外将分选出的哮喘急性加重小鼠的肺CD4+T淋巴细胞与巨噬细胞混合培养,并在此混合培养体系中加入补肾益气方及其主要成分单体组合进行体外干预,干预后利用流式细胞术检测共培养的肺脏CD4+T淋巴细胞中Th1、Th2和Th17比例：RT-PCR法检测共培养并被药物干预的CD4"T淋巴细胞的GATA3、T-bet、STAT6、RORy T等转录因子及巨噬细胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ及Clec4e等共刺激分子或活化标志分子mRNA的表达水平；激光共聚焦显微镜技术检测共培养且药物干预后的巨噬细胞的变化。结果(1)与正常对照组比较：哮喘模型组小鼠的气道反应性、气道炎症以及血清与肺泡灌洗液中特异性IgE的分泌显著上调(P<0.05),且肺脏Th1、Th2、Th17细胞应答(包括相应转录因子的表达、细胞因子的分泌等)水平均出现上调,但Thl应答上调的程度弱于Th2与Th17；(2)与哮喘组相比,RSV诱发哮喘急性加重组小鼠肺脏RSV病毒负载量显著增加,差别具有统计学意义(P<0.05),表明RSV感染成功。其气道反应性、气道炎症进一步加重,血清与肺泡灌洗液中特异性IgE的分泌进一步增多,但同哮喘组相比差别均无统计学意义(P>0.05)。此外同哮喘组相比,哮喘急性加重小鼠肺脏Th2、Th17细胞应答水平(包括相应转录因子的表达、细胞因子的分泌等)也均进一步上调,但Thl应答却出现下调；(3)与哮喘急性加重组比较：补肾益气方干预后,小鼠的气道高反应性和气道炎症显著减轻(P<0.05),血清与肺泡灌洗液中特异性IgE的分泌显著减少(P<0.05),病变肺组织的病毒负载量显著减少(P<0.05)；(4)体外细胞学实验与体内动物实验的结果均表明：补肾益气方干预后,哮喘急性加重小鼠肺脏Th2、Th17细胞应答(包括相应细胞数量比例、转录因子的表达、细胞因子的分泌等)水平均显著下调(P<0.05),同时Th1细胞应答在药物的干预下显著增强(P<0.05)；(5)体外细胞学实验结合体内动物实验发现：补肾益气方干预治疗后,哮喘急性加重小鼠肺脏巨噬细胞被激活,其活化标志分子、共刺激分子的表达及吞噬OVA能力均显著增强(P<0.05)。结论进一步佐证了哮喘急性加重小鼠模型的炎症特征为以Th2、Th17为优势的变应性炎症。而作为中医学扶正之法的经验方药,补肾益气方可有效缓解哮喘急性加重过程中的气道高反应性与气道炎症损伤,其炎症缓解机制可能与该方药能有效逆转病变小鼠Thl与Th2-Th17应答失衡有关。此外该方药还能有效抑制RSV在被感染小鼠体内的复制。本实验明确了补肾益气方具有免疫调节和抗病毒的双重作用,更证实了补肾益气等扶正之法在防治哮喘发作或加重中也具有重要价值。第三部分补肾益气方与清热活血方对哮喘加重小鼠炎症干预效应的对比研究目的同补肾益气方一样,清热活血方也是本课题组经长期经验积累,所提出的能够防治哮喘的有效方药,本实验研究的目的在于对比补肾益气方与清热活血方对哮喘急性加重小鼠模型的干预情况,寻找补肾益气方与清热活血方,作为分别能够体现中医学扶正思想与祛邪思想的经验方药,其在防治病毒感染诱发哮喘急性加重中可能存在的规律性差异。方怯按照随机数字法,将4周龄的BALB/c小鼠分为正常对照组、哮喘模型组、RSV诱发哮喘急性加重组、地塞米松组与清热活血方(低、中、高剂量)组。除清热活血方三个组外,其它各组均与第二部分实验共用。低、中、高剂量的清热活血方干预组,在哮喘急性加重小鼠模型的基础上,应用相应剂量的中药灌胃给药,模型组用等量生理盐水代替药物灌胃。最后一次激发24 h后,采用Buxco肺功能仪检测小鼠气道反应性；肺组织病理HE、PAS染色并观察分析；对肺组织RSV病毒负载量进行检测；利用血细胞计数仪对肺泡灌洗液中浸润的炎症细胞进行分类与计数；ELISA法测定肺泡灌洗液中的IL-4、IL-5、IL-6、IL-17a、IL-12和INF-y等细胞因子以及血清与肺泡灌洗液中特异性IgE的分泌水平：体外分离各组小鼠的肺脏CD4+T淋巴细胞与巨噬细胞,利用RT-PCR法检测CD4-T淋巴细胞GATA3、T-bet、STAT6、RORy T等转录因子及巨噬细胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ及Clec4e等共刺激分子或活化标志分子mRNA的表达水平；体外将分选的哮喘急性加重小鼠的肺CD4+T淋巴细胞与巨噬细胞混合培养,并在此混合培养体系中加入清热活血方进行体外干预,干预后利用流式细胞术检测共培养后的肺脏CD4-T淋巴细胞中Th1、Th2和Th17比例；RT-PCR法检测共培养并被药物干预的CD4+T淋巴细胞的GATA3、T-bet、STAT6、RORy T等转录因子及巨噬细胞CI)80、CD86、MHC-Ⅱ及Clec4e等共刺激分子或活化标志分子mRNA的表达水平；激光共聚焦显微镜技术检测共培养且药物干预后的巨噬细胞的变化。结果与哮喘急性加重模型组相比,清热活血方干预后小鼠气道高反应性和气道炎症显著减轻(P<0.05),血清与肺泡灌洗液中特异性IgE的分泌显著减少(P<0.05),病变肺组织的病毒负载量亦显著减少(P<0.05)。结合动物实验与体外细胞学实验的结果发现：清热活血方干预后,哮喘急性加重小鼠肺脏Th2、Th17应答(包括相应细胞数量比例、转录因子的表达、细胞因子的分泌等)水平均显著下调(P<0.05),同时Thl应答水平与巨噬细胞的活化(包括活化标志分子、共刺激分子的表达以及其吞噬OVA水平等)在药物的干预后亦被抑制。结论作为中医学祛邪思想的经验方药,清热活血方也可有效缓解哮喘急性加重过程中的气道高反应性与气道炎症损伤,其炎症缓解机制可能与该药能显著抑制病变小鼠过度的Th2-Th17应答有关。该方药也能有效抑制RSV在被感染小鼠体内的复制,且清热活血方的抗病毒与抗局部气道炎症的效果略强于补肾益气方,而补肾益气方对哮喘急性加重小鼠整体病理状态的改善优于清热活血方。