胶质瘤作为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,因其难根治和易复发的特性,一直以来都是神经外科医生的巨大挑战。“最大安全范围切除”的手术理念使胶质瘤患者的生存时间得到一定程度的改善,但复发仍难以避免。因为,胶质瘤作为高度浸润性生长的肿瘤,它与正常脑组织之间没有明确边界,其浸润性生长的范围远远超越了手术显微镜下所见到的胶质瘤假边界、影像学上的边界甚至病理切片上的边界,从而导致胶质瘤实际上无法达到真正意义上的全切除。这也是胶质瘤复发的根源,己经浸润到影像学边界以外的肿瘤细胞,而不是己经手术切除的肿瘤实质细胞,才是经历同步放化疗及辅助化疗之后依然不被消灭,伺机复发的关键所在。因此我们认为,胶质瘤这两种不同区域的细胞具有差异,而这种差异值得我们深入研究,正是这种差异性左右着肿瘤的生物学行为,最终影响患者的预后。课题组前期已经分离并培养出高级别胶质瘤两种不同区域的肿瘤细胞,从肿瘤中心实质部分(核磁共振(Magnetic resonance imaging,MRI)T1增强相)取材、分离并培养出的肿瘤细胞命名为C细胞(C细胞提示肿瘤细胞位于中心Central、增强区域Contrast,是普遍存在的Common),而从瘤周水肿带甚至更外围区域(MRI T2/FLAIR相异常信号区及以远)取材、分离并培养出的肿瘤细胞命名为Q细胞(Q细胞提示这部分肿瘤细胞往往在治疗过程中长期处于静息状态Quiescent,是值得深入研究,充满未知挑战的问题细胞Question cell)。一共分离培养了 30余对Q细胞和C细胞,细胞组化显示两种细胞GFAP染色阳性,裸鼠颅内原位成瘤实验两种细胞均可成瘤,以上鉴定实验证实Q细胞确实是肿瘤细胞。同时,对Q细胞、C细胞进行了细胞功能研究,发现:Q细胞的增殖慢于C细胞,凋亡少于C细胞,迁移、侵袭的能力弱于C细胞。两种不同区域的肿瘤细胞,在诸多生物特性上显示出了差异,本研究关注于它们在代谢、能量通路上的差异及意义,并探讨其可能的调控机制。细胞色素 c 氧化酶亚基 7A2(Cytochrome c oxidase subunit 7A2,COX7A2)是课题组前期通过随机选取6对Q细胞和C细胞,基于同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术的蛋白质组学研究发现的线粒体呼吸链相关蛋白,在Q细胞中表达显著上调。本研究提示COX7A2是线粒体呼吸链活性的关键调节因子,是造成Q细胞和C细胞在代谢、能量通路上差异的关键因子,可作为胶质瘤患者评判预后的独立预测因子。第一章高级别胶质瘤不同区域肿瘤细胞的代谢组学分析目的:本章节将分析Q细胞与C细胞在代谢产物上的差异性。方法:随机选取6对Q细胞与C细胞,经液相串联质谱实验得到LC-MS/MS的原始质谱数据。按照XCMS Online平台的工作流程,将原始质谱数据转换格式后上传,选取Pairwise Job模式,设置工作参数HPLC/Q-TOF,提交后软件自动运行分析数据,运行完毕后即可读取结果。当差异倍数达到1.5倍及以上,且经统计检验其P值小于或等于0.05时,视为差异代谢产物特征。结合METLIN metabolite database的资料搜索、鉴定差异的代谢产物。结果:XCMS Online使用非线性方法补偿样本之间保留时间的漂移,重叠显示保留时间校正之前的总离子流色谱图(TIC)、保留时间校正之后的TIC和保留时间校正曲线,使代谢产物数据得到严格的质量控制。Cloud Plot显示Q细胞与C细胞相比,有3249个差异的代谢产物特征,下调的特征数量显著多于上调的特征。PCA及MDS显示C细胞代谢产物分离度大,Q细胞代谢产物分离度小。MAS鉴定Q细胞与C细胞差异代谢产物:在Q细胞中表达下调的代谢产物前五名分别为:硫酸茚地那韦、苦木内酯M、苦木内酯N、翼伞甙Z、SecoeremopetasitolideB;在Q细胞中表达上调的代谢产物前五名分别为:N-(十六酰基)-鞘氨醇、(24R)-1α,24-二羟基-22-氧代硬脂醇缩酚醇、1 a,25-二羟基-22-氧代胆钙化甾醇、硫代环丙沙星、Momordicilin。结论:Q细胞与C细胞在代谢产物上存在显著不同。C细胞的代谢产物多样化,证明肿瘤中心的细胞具显著异质性,且代谢水平较高;Q细胞位于瘤周边缘地带,其异质性较低,代谢水平也较低。第二章高级别胶质瘤不同区域肿瘤细胞线粒体代谢相关差异蛋白分析目的:本章节重点研究高级别胶质瘤不同区域肿瘤细胞——Q细胞与C细胞的差异,对线粒体代谢相关差异蛋白进行分析,鉴定线粒体呼吸链活性关键调节蛋白COX7A2是否是造成Q细胞与C细胞差异的关键因子。方法:利用生物信息学的分析手段,结合cBioportal、Uniprot、BioGrid在线软件和FunRich软件,对与COX7A2在mRNA水平共表达的基因、与COX7A2在蛋白水平相互作用的蛋白进行了 GO分析(GeneOntology analysis)。回顾课题组前期通过液相串联质谱实验得到的6对Q细胞和C细胞的原始质谱数据,完整、系统地进行Q细胞、C细胞差异蛋白的分析,应用GO及Pathway分析,研究Q细胞与C细胞在哪些分子功能、生物过程上具有差异。结果:针对COX7A2的生物信息学分析表明其在胶质瘤细胞中发挥功能的场所主要集中于线粒体,主要参与代谢及能量通路,执行的最主要分子功能为:氧化还原酶活性。GO分析表明Q细胞和C细胞差异表达蛋白在催化活性、连接酶活性、氧化还原酶活性这三个分子功能上所占的比例最高;在代谢和能量通路的生物过程上具有广泛而显著的差异;细胞组成上,两者之间线粒体的差异排名第一。Pathway分析再次证明,Q细胞与C细胞在代谢上具有显著的差异性,有众多差异蛋白参与到了代谢通路的调节上。Q细胞与C细胞蛋白差异分析发现,6组差异蛋白聚类未能发现上调或下调的差异蛋白,5组差异蛋白聚类发现2个上调蛋白,1个下调蛋白。4组差异蛋白聚类发现17个上调蛋白,30个下调蛋白。结论:Q细胞与C细胞在代谢和能量通路上存在显著的差异,线粒体是具主导地位的细胞器,其中线粒体呼吸链活性关键调节蛋白COX7A2是5组、4组差异蛋白聚类共同发现的上调蛋白,是造成Q细胞与C细胞在代谢和能量通路上显著差异的关键因子,具有深入研究的意义。另外两个线粒体代谢相关差异蛋白:上调的NDUFS8、下调的PKM2也具有重要的功能。第三章线粒体呼吸链关键调节蛋白COX7A2对胶质瘤患者预后的影响及机制研究目的:本章节研究第二章筛选出的线粒体呼吸链关键调节蛋白COX7A2在胶质瘤不同级别、不同区域的表达情况,并分析COX7A2对胶质瘤患者预后的影响,探讨COX7A2作为预测胶质瘤患者预后指标的价值,以及研究造成COX7A2对预后产生影响的机制。方法:免疫组化检测COX7A2在126例胶质瘤临床样本的表达,其中83例同时包含MRIT1增强相(C细胞区域)和MRIT2/FLAIR相以外(Q细胞区域)的取材样本。126例患者术后随访资料完整,随访时间4—51个月(平均18.42±10.34个月)。结合患者的临床病理资料,进行Kaplan-Meier生存分析、单因素及多因素COX回归分析。R2在线软件分析TCGA、French、Kawaguchi等胶质瘤数据库资料。Western Blot、qPCR检测COX7A2在胶质瘤细胞系中的表达。CCK-8检测瞬时转染COX7A2 siRNA后胶质瘤细胞系细胞的增殖变化。同时,对另外两个线粒体代谢相关差异蛋白NDUFS8、PKM2,也利用R2在线软件进行Kaplan-Meier生存分析。结果:126例胶质瘤临床样本中86例(68.3%)COX7A2高表达,40例(31.7%)低表达。83例胶质瘤患者的Q细胞取材区标本中,68例(81.9%)COX7A2高表达,15例(18.1%)低表达。Q细胞区COX7A2高表达率高于C细胞区(P=0.028)。COX7A2的表达与胶质瘤WHO分级关联密切(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析显示COX7A2高表达的患者总生存时间更长,预后更好。R2在线软件分析TCGA、French、Kawaguchi等胶质瘤数据库资料均证实上述结果。单因素及多因素COX回归分析表明COX7A2高表达是胶质瘤患者预后的独立预测因子。胶质瘤细胞系中U87MG的COX7A2表达最低,其细胞的增殖率最高。瞬转COX7A2siRNA后各胶质瘤细胞系细胞增殖率均下降。TMZ刺激1周,U87MG细胞NC siRNA组的增殖速率下降幅度显著大于COX7A2 siRNA组。另外,NDUFS8高表达的患者预后好,PKM2高表达的患者预后差。结论:COX7A2可作为胶质瘤患者评判预后的独立预测因子。COX7A2影响预后的机制可能与对TMZ敏感性的改变有关。结合COX7A2、NDUFS8、PK]M2三者的表达情况,能更准确预测胶质瘤患者的预后。