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第一部分 十二指肠空肠旁路术、胆汁转流术及高胆汁酸喂养对2型糖尿病大鼠的治疗作用以及其血清胆汁酸变化背景糖尿病已经成为危害人类健康的最重要的一种代谢性疾病,目前,全球糖尿病人群已达4亿以上,而且呈逐年增高的趋势,预计到2040年,糖尿病患者数量将达到近7亿,其预防及治疗费用高达近7000亿美元。糖尿病患者中,2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)占90%以上,传统的针对的强化胰岛素疗法存在着长期医疗花费高、依从性差、并发症发生率高等先天性缺陷,因此,寻找长期、稳定的糖尿病治疗手段已成为急需解决的的公共卫生课题。近年来,伴随减重代谢外科发展应运而生的减重/代谢手术(Bariatric/metabolic surgery)为T2DM的治疗提供了一种新的思路。前期研究已表明,对于T2DM的治疗效果,减重/代谢手术优于传统内科治疗。而且,中华医学会糖尿病学分会、美国糖尿病协会(ADA)和国际糖尿病联盟(IDF)等国际学术组织已将其作为T2DM的重要治疗手段进行推荐。十二指肠空肠旁路术(Duodenal-jejunal bypass,DJB)就是减重/代谢手术中的一种常用术式,它在不依赖体重减轻的的前提下,可以迅速、持久地改善T2DM相关临床指标,但其具体机制尚不明。已有研究表明,由于DJB改变了上消化道消化液的引流顺序、特别是胆汁的流向,可能导致术后血清胆汁酸水平的变化。新进研究发现,由于胆汁酸是调节机体糖及脂肪代谢的重要信号分子,DJB改善T2DM的治疗效果可能与胆汁酸代谢相关,但其中机制尚不明确。目的选用Wistar大鼠经由高脂饮食(High-fat-diet,HFD)联合链脲霉素(Streptozotocin,STZ)的方法,得到的T2DM大鼠模型。设计三个实验组及一个对照组,分别为:DJB术组、胆汁转流术组(Bile diversion,BD)、胆汁酸喂养组(Taurocholic Acid,TCA)+假手术(SHAM)和SHAM组。通过对比各组对T2DM大鼠的治疗效果,探讨:(1)BD手术以及胆汁酸喂养与DJB手术相比对T2DM大鼠的治疗效果有何差别;(2)各组大鼠术后胆汁酸变化情况是否有差别。方法选取共40只通过STZ+HFD诱导的方法得到T2DM大鼠模型,将其平均分为4组,每组10只,分别给与DJB术,BD术,SHAM术+TCA和SHAM术。通过内源性和外源性的方法提高肠道胆汁酸的给予量,连续观察实验大鼠的进食量、体重等一般数据变化,分别在术后2周和12周两个时间点检测实验大鼠的以下指标:血糖、血胆汁酸、胰岛素、动态评价胰岛素敏感性指标(Matsuda index)、胃内葡萄糖耐量试验(Intragastric glucose tolerance test,IGGTT)胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)、肝功等指标。通过以上指标对比不同治疗手段对于T2DM大鼠的治疗效果,并观察各组实验大鼠血清胆汁酸水平的变化情况有无差别。结果1.术前和术后观察期内,各组大鼠体重变化无统计学差异(P>0.05)。术前各组大鼠日常进食量无统计学差异(P>0.05),术后2周和12周时DJB组大鼠进食量低于其余三组,差别有统计学意义(P<0.05);而BD组、SHAM+TCA组和SHAM组之间大鼠进食量无统计学差异(P>0.05)。2.各组实验大鼠的术前空腹血糖和IGGTT结果无统计学差异(P>0.05)。术后2周和12周,DJB组、BD组和SHAM+TCA组大鼠空腹血糖及AUCIGGTT数值较术前基线水平均显著下降,而且均明显低于同时间点的SHAM组(P<0.05),但DJB组、BD组和SHAM+TCA组间的大鼠空腹血糖及AUCIGGTT水平无统计学差异(P>0.05)。术后12周,BD组和SHAM+TCA组的空腹血糖及AUCIGGTT均高于DJB组(P<0.01)。3.术前及术后观察期内,各组大鼠的血清胰岛素水平无显著差异(P>0.05)。术后2周时,DJB组的Matsudaindex均高于另外三组,其差别有统计学意义(P<0.05);而此时BD组、SHAM+TCA组和SHAM组之间Matsuda index均无统计学差异(P>0.05)。术后12周时,DJB组、BD组和SHAM+TCA组的Matsuda index均显著高于SHAM组(P<0.05);而且DJB组又显著高于BD组和SHAM+TCA 组(P<0.05);但 BD 组和 SHAM+TCA 组之间的 Matsuda index 无统计学差异(P>0.05)。4.术后2周,各组实验大鼠血清GLP-1水平无统计学差异(P>0.05)。而到了术后12周,D JB组、BD组和SHAM+TC A组的血清GLP-1均显著高于SH AM组(P<0.05);而且,DJB组的血清GLP-1水平显著高于BD组和SHAM+TCA组;但BD组和SHAM+TCA之间的GLP-1水平差异无统计学意义。5.实验大鼠血清总胆汁酸检测方面:术后2周时,BD组和SHAM+TCA组显著高于SHAM组(P<0.05);而DJB组与SHAM组之间无明显统计学差异(P>0.05);BD组和SHAM+TCA组与DJB组间比较,其血清总胆汁酸水平有统计学差异(P<0.05)。但到术后12周时,SHAM组血清总胆汁酸水平较2周时无变化,而BD组和SHAM+TCA组,特别是DJB组,均进一步升高,并显著高于SHAM组(P<0.05);此时,BD组、SHAM+TCA组和DJB组之间血清总胆汁酸水平差别无统计学差异(P>0.05)。6.术后2周各组间肝功指标比较显示,血清ALB、ALT、AST和TBIL差异无统计学意义(P>0.05)。但术后12周时,BD组、DJB组和SHAM+TCA组肝功指标明显优于SHAM组,其差别有统计学意义(P<0.05)。而且,DJB组实验大鼠的血清肝功指标明显优于BD组和SHAM+TCA组,其差别有统计学意义(P<0.05)。结论1.在改善T2DM大鼠的糖代谢效果方面,DJB手术效果最佳,而BD手术和SHAM手术+TCA的方法效果稍逊。2.DJB手术、BD手术和SHAM手术+TCA的方法均可以引起血清总胆汁酸水平的显著升高,但在DJB手术中,血清总胆汁酸水平的变化与时间相关。3.DJB手术对T2DM大鼠的治疗效果中,胆汁酸发挥重要作用。但例如肠促激素和近端小肠脂质感受机制等其他因素,可能也是参与DJB手术治疗T2DM效果的重要方面。第二部分 十二指肠空肠旁路术、胆汁转流术及高胆汁酸喂养对T2DM大鼠血清胆汁酸构成的影响背景近些年已有研究发现,在几乎所有类型的减重及代谢外科手术中,术后病人的血清胆汁酸水平均有普遍升高的现象,由此可以推论,胆汁酸的变化在手术治疗T2DM中发挥重要作用。以往认为肝脏合成并分泌的胆汁酸主要作用在于调节脂类和脂溶性维生素的消化及吸收。而新进研究发现,胆汁酸在调节机体能量代谢、特别是葡萄糖和脂肪代谢方面起到了重要作用:首先,作为法尼醇X受体(Farnesoid X receptor,FXR)的天然配体,胆汁酸有着减少肝脏糖异生、进而降低脂肪合成的作用;其次,胆汁酸还能通过激活G蛋白偶联受体(TGR5),进而提高基础代谢率并增加能量消耗。由于胆汁酸并非一种单一成分物质,而是由20余种不同类型的胆汁酸构成的混合物,而且这其中的每一种成分都有不同的作用。以对FXR的作用为例,胆酸(Cholic acid,CA)对其仅有微弱的激活作用,而鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)却有强效激活作用,但是熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)和β鼠胆酸(β-muricholic acid,β-MCA)则对FXR有着抑制作用。与此同时,对于TGR5而言,牛磺酸结合型胆汁酸是其强效的激活剂。有以上背景知识可以推论,认识减重代谢外科术后血清胆汁酸各构成成分的具体变化,能帮助发现手术治疗T2DM的相关机制。但是,现有的常规检测方法,尚无法对总胆汁酸的具体构成成分进行分类检测。目的本实验部分以第一部分实验大鼠术前、术后2周和术后12周的血清为实验标本,研究以下问题:DJB手术、BD手术、SHAM手术+TCA和SHAM手术后血清胆汁酸构成成分的具体的变化,并进行组间比较。方法在本部分实验中,我们将第一部分实验大鼠术前、术后2周和术后12周的血清作为实验标本,藉由高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS),进行血清胆汁酸具体构成成分的定量分析。结果在四组胆汁酸绝对值检测中CA都是含量最高的胆汁酸。术后2周,DJB组TαMCA、TCA、TCDCA、TUDCA和TLCA的含量很低,但显著高于SHAM组(P<0.05);BD组胆汁酸谱变化与DJB组类似,但差异无显著统计学意义(P>0.05);TCA+SHAM 组大鼠αMCA、βMCA、CA、CDCA、UDCA、HDCA 和 TCA显著增高,与SHAM组比较有显著统计学差异(P<0.05),其中TCA显著高于其他三组(P<0.05)。术后 12 周,DJB 组的αMCA、βMCA、CDCA、UDCA、LCA和所有牛磺酸结合型胆汁酸水平均显著高于SHAM组(P<0.05)。与术后2周时相比,DJB组TUDCA上升近40倍,TLCA和TαMCA上升近20倍;BD组各种类型胆汁酸较2周时均有不同程度升高,但无统计学差异(P>0.05);TCA+SHAM组CA及TCA含量进一步上升,显著高于其余三组(P<0.05)。如图2所示的血清胆汁酸谱百分比比较。术后2周,SHAM组和DJB组相比,各类型胆汁酸的比例无显著统计学差异(P>0.05)。术后12周,除TDCA和TCDCA外,DJB组所有牛磺酸结合型胆汁酸的比例均显著高于SHAM组(P<0.05)。BD组总体变化与其他三组均不相同,牛磺酸结合型胆汁酸比例仅有小幅变化。TCA+SHAM组在术后2周时变化不显著,但术后12周时TCA升高明显,可能与TCA饲喂相关。结论1.T2DM大鼠在实施DJB术、BD术和高TCA喂养后,血清总胆汁酸水平显著升高,这其中升高比例最大的是牛磺酸结合型胆汁酸。2.T2DM大鼠在实施DJB术、BD术和高TCA喂养后,FXR激动剂/FXR抑制剂的比值明显减小,说明减重/代谢手术后作为FXR抑制剂胆汁酸亚型改变较为显著,并进一步通过抑制FXR通路的作用产生影响糖脂代谢的结果。