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葡萄糖二酸(glucaric acid, GA)作为具有高价值的生物提炼品，被普遍的应用于食品、化工和医疗等领域。目前市场上的GA大多通过化学合成的方法而获得，但这种方法因具有催化剂昂贵、副产物多及污染环境等缺点，限制了GA在工业规模上的扩大。以细菌为基础的GA生物合成法具有高效、无污染、低成本等优点，是未来代替化学法合成GA的一个潜在手段。
GA的生物合成法在近十年的研究中取得了飞速的发展。在2008年，麻省理工科研团队率先实现对大肠杆菌进行代谢工程改造使其具备合成GA的能力。在此之后，大量的合成生物学手段被应用于GA的合成途径并使得GA的产量获得了提高。但是，目前GA的生物合成法存在以下问题，限制了GA产量的进一步提升:(1)肌醇氧化酶(myo-inositol oxygenase，MIOX)为GA合成途径中的关键限速酶，酶活性较弱(2)大肠杆菌为宿主菌时，产物GA对宿主菌的生长产生酸毒性。相对于大肠杆菌，酵母具有繁殖速度快、耐酸等优点，将宿主菌更换为酵母或许是一个更好的选择。
此外，生物传感器因其可以有效响应小分子物质的浓度而被广泛应用于合成生物学的研究中。GA响应生物传感器最早由Church的科研团队于大肠杆菌中发现，但是关于该GA响应启动子的工作机制未被报导。在本课题组之前的的研究中，成功分析出GA响应启动子的核心区域并对其工作机理做出预测。基于GA响应启动子的核心区域及其作用机制，本论文对GA响应启动子元件进行改造并将改造后的启动子元件应用到GA高产菌株筛选体系的构建中。具体内容如下:
(1)基于GA响应启动子F291-390，本论文将其应用于GA高产菌株筛选体系的构建研究中。本论文根据筛选原理的不同设计了三种GA高产菌株筛选体系。分别将四环素抗性基因(tetA)、SDS抗性基因(tolC)以及卡那抗性基因(kanaR)作为报告基因放到GA响应启动子的下游，使得抗性基因的转录水平受到GA浓度所调控。从而在一定的外部筛选压力下，将菌株生长速度与GA浓度相偶联，建立线性关系。TetA作为GA高产菌株的筛选基因时，GA大量进入胞内，使得菌体因酸中毒而生长速度缓慢;TolC作为GA高产菌株的筛选基因时，菌株在较高浓度SDS溶液中会出现凝聚成团以及部分死亡情况，不利于后续传代培养;kanaR作为GA高产菌株的筛选基因时，可以有效的筛选GA高产菌株，但是该筛选体系的筛效率较低，需要一个响应GA能力更强的启动子来调控卡那抗性基因的表达
(2)本论文利用易错PCR技术将GA响应启动子的核心区域进行随机突变，将其构建到表达绿色荧光蛋白的质粒上并转入DH5a。通过测定在有无GA下菌体所呈现的荧光强度，在500个突变体中筛选出4个GA响应能力具有不同程度增强的启动子突变体。其中突变体F291-390-164del-165del-177G-188A响应GA动态范围为突变前的7.2倍，灵敏度为9.2倍。
(3)本论文将构建得到的GA响启动子再次应用于GA高产菌株筛选体系的构建研究中。根据前面章节的讨论分析，本章将卡那抗性基因(kanaR)作为报告基因放到启动子突变体的下游，使得抗性基因的转录水平受到GA浓度所调控。从而在一定的外部筛选压力下，将菌株生长速度与GA浓度相偶联，建立线性关系。通过对筛选体系的有效性进行比较，最终成功构建了一个以卡那抗性基因为基础的GA高产菌株筛选体系，为后续关键催化分子及高产菌株的高通量筛选提供了一种有效的技术平台。
GA的生物合成法在近十年的研究中取得了飞速的发展。在2008年，麻省理工科研团队率先实现对大肠杆菌进行代谢工程改造使其具备合成GA的能力。在此之后，大量的合成生物学手段被应用于GA的合成途径并使得GA的产量获得了提高。但是，目前GA的生物合成法存在以下问题，限制了GA产量的进一步提升:(1)肌醇氧化酶(myo-inositol oxygenase，MIOX)为GA合成途径中的关键限速酶，酶活性较弱(2)大肠杆菌为宿主菌时，产物GA对宿主菌的生长产生酸毒性。相对于大肠杆菌，酵母具有繁殖速度快、耐酸等优点，将宿主菌更换为酵母或许是一个更好的选择。
此外，生物传感器因其可以有效响应小分子物质的浓度而被广泛应用于合成生物学的研究中。GA响应生物传感器最早由Church的科研团队于大肠杆菌中发现，但是关于该GA响应启动子的工作机制未被报导。在本课题组之前的的研究中，成功分析出GA响应启动子的核心区域并对其工作机理做出预测。基于GA响应启动子的核心区域及其作用机制，本论文对GA响应启动子元件进行改造并将改造后的启动子元件应用到GA高产菌株筛选体系的构建中。具体内容如下:
(1)基于GA响应启动子F291-390，本论文将其应用于GA高产菌株筛选体系的构建研究中。本论文根据筛选原理的不同设计了三种GA高产菌株筛选体系。分别将四环素抗性基因(tetA)、SDS抗性基因(tolC)以及卡那抗性基因(kanaR)作为报告基因放到GA响应启动子的下游，使得抗性基因的转录水平受到GA浓度所调控。从而在一定的外部筛选压力下，将菌株生长速度与GA浓度相偶联，建立线性关系。TetA作为GA高产菌株的筛选基因时，GA大量进入胞内，使得菌体因酸中毒而生长速度缓慢;TolC作为GA高产菌株的筛选基因时，菌株在较高浓度SDS溶液中会出现凝聚成团以及部分死亡情况，不利于后续传代培养;kanaR作为GA高产菌株的筛选基因时，可以有效的筛选GA高产菌株，但是该筛选体系的筛效率较低，需要一个响应GA能力更强的启动子来调控卡那抗性基因的表达
(2)本论文利用易错PCR技术将GA响应启动子的核心区域进行随机突变，将其构建到表达绿色荧光蛋白的质粒上并转入DH5a。通过测定在有无GA下菌体所呈现的荧光强度，在500个突变体中筛选出4个GA响应能力具有不同程度增强的启动子突变体。其中突变体F291-390-164del-165del-177G-188A响应GA动态范围为突变前的7.2倍，灵敏度为9.2倍。
(3)本论文将构建得到的GA响启动子再次应用于GA高产菌株筛选体系的构建研究中。根据前面章节的讨论分析，本章将卡那抗性基因(kanaR)作为报告基因放到启动子突变体的下游，使得抗性基因的转录水平受到GA浓度所调控。从而在一定的外部筛选压力下，将菌株生长速度与GA浓度相偶联，建立线性关系。通过对筛选体系的有效性进行比较，最终成功构建了一个以卡那抗性基因为基础的GA高产菌株筛选体系，为后续关键催化分子及高产菌株的高通量筛选提供了一种有效的技术平台。