近年来,随着化石燃料资源的枯竭和环境污染问题的日益严峻,越来越多的研究开始致力于从可再生基质生产生物燃料以替代传统的化石燃料。醇类的清洁性、易燃性、可再生性以及其可与汽油等混合使用等特点,使其可作为一种理想的生物燃料。其中,异丁醇具有更高的辛烷值和能量密度,更低的吸湿性且更溶于水,因而不需要掺入汽油便可直接使用,并且依靠现有的汽油输送管道便能进行运输,因此异丁醇可成为替代汽油的极具发展潜力的新一代生物燃料。木质纤维素是自然界中最丰富的资源,主要来自植物细胞壁,可再生且可持续使用。天然木质纤维素结构复杂,难于分解,很难直接作为原料。因此,通过物理、化学或生物的方法降解木质纤维素获得的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等单糖可作为微生物化合物合成底物的重要来源。由于木糖在大肠杆菌中的利用速率较慢,因此利用木糖合成异丁醇较少受到研究者的关注。在野生型大肠杆菌中,木糖主要通过异构酶途径进入细胞并进入磷酸戊糖途径被细胞利用。但是该途径的木糖吸收利用速度较慢,同时由木糖获得大肠杆菌中心代谢途径的重要中间产物丙酮酸和乙酰辅酶A的途径较长,因此也进一步影响了大肠杆菌以木糖为碳源的细胞生长状况。为了解决这个问题,我们在大肠杆菌中引入了Dahms途径,期望通过较短的酶促反应步骤获得丙酮酸以改善菌体的生长状况。首先在大肠杆菌中敲除了木糖异构酶Xyl A和木酮糖激酶Xyl B,并将Dahms途径中的木糖脱氢酶Xdh、木质酸脱水酶Yag F、2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶Yag E、谷氨酸丙酮酸转氨酶Ald A、异柠檬酸裂解酶Ace A以及异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶Ace K进行过量表达。之后,我们在大肠杆菌中导入了外源的Ehrlich途径,实现了由丙酮酸合成异丁醇。至此,我们成功建立了一条由木糖合成异丁醇的完整途径。经过分批发酵,重组菌株BWL2能够积累64.8 mg/L的异丁醇。考虑到异丁醇合成途径中需要较多还原力的参与,而降低细胞内的电子传递链活性可以有效提高大肠杆菌细胞内NADPH与NADH的水平。我们敲除了编码泛醇末端氧化酶Ⅲ的cbd基因,并利用编码木糖脱氢酶的xdh基因替换了编码泛醇末端氧化酶Ⅰ的cyo基因,利用编码木糖转运ABC蛋白的xyl FGH基因替换了编码NADH酶Ⅰ的nuo基因。由此得到的重组菌株BWL4,可以由20 g/L的木糖合成224.5mg/L的异丁醇。为了继续提高重组菌株的生长及异丁醇合成,我们接下来尝试了利用葡萄糖与木糖的混合碳源合成异丁醇,期望大肠杆菌可以利用木糖维持其生长,同时利用葡萄糖合成异丁醇,避免细胞生长和异丁醇合成的交叉冲突。考虑到大肠杆菌碳分解代谢物阻抑（CCR）会阻碍大肠杆菌对葡萄糖和木糖的同时利用,因此我们首先敲除了菌株中编码PTS转运系统酶IIBC组分的pts G基因,解除了CCR。之后对大肠杆菌利用葡萄糖生产丙酮酸的ED途径进行了改造,利用zwf（编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶）基因替换pgi（编码葡萄糖磷酸异构酶）基因,pgl（编码葡萄糖6-脱氢酶）基因替换gnd（编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶）基因,edd（编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶）基因替换pta（编码磷酸乙酰转移酶）基因,eda（编码2-酮-3-脱氧葡萄糖酸6-磷酸醛缩酶）基因替换ack A（编码乙酸激酶）基因。对获得的重组菌株WED6进行了分批发酵检测,其异丁醇的产量可达352.19 mg/L。作为三种芳香族氨基酸之一,L-苯丙氨酸广泛用于食品添加剂与动物饲料中。特别是其可以用于低热量甜味剂阿斯巴甜的生物合成,因此世界范围内对L-苯丙氨酸的需求日益增长。由于具有生产周期短、原料廉价、工艺环保等有点,利用微生物直接发酵合成L-苯丙氨酸成为了主要的生产方式。在大肠杆菌中,影响L-苯丙氨酸生产的关键因素是两个前体物磷酸烯醇式丙酮酸PEP和赤藓糖4-磷酸E4P的细胞内水平。在大肠杆菌中,葡萄糖转运系统PTS消耗了细胞内约50%的PEP。因此,我们首先敲除了编码PTS酶IIA的pts I基因。然而敲除该基因后,菌株的葡萄糖利用速率大幅降低。因此之后我们通过导入来自运动发酵假单胞菌的葡萄糖促进扩散蛋白Glf提高重组菌株的葡萄糖利用速率。之后,我们通过敲除编码丙酮酸脱氢酶的pox B以及编码磷酸乙酰转移酶的pta减少乙酸的分泌,并通过过表达编码磷酸烯醇式丙酮酸合酶的pps A与编码转酮醇酶的tkt A基因,增加两种前体物的细胞内水平。通过过量表达解除反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶aro Gfbr与分支酸变位酶phe Afbr,进一步增加流入L-苯丙氨酸合成途径的碳流量。最后,通过过量表达L-苯丙氨酸的转运蛋白Ydd G,提高L-苯丙氨酸的分泌水平。经过上述改造得到的重组大肠杆菌可以合成1.69 g/L的L-苯丙氨酸。