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目的构建分泌表达抗Aβ42胞内抗体的重组腺相关病毒,为进一步研究胞内抗体靶向识别、清除细胞内Aβ42以达到诊断和治疗AD提供了基础材料。方法①根据GenBank提供的Aβ42单克隆抗体的已知序列(专利号WO2008/156621 A1),选用Aβ42单克隆抗体重、轻链可变区CDR1和CDR3及其重链的骨架结构,设计构建了细胞内抗体mAbA/B, (mAbA:VHCDR1-VLCDR3; mAbB: VHCDR3-VLCDR1)应用DNASIS计算机软件设计引物。用非对称互补引物／模板法,上游5’端加入保护碱基和PmaCI酶切位点,下游3’端加入终止密码子TAG和BamHI酶切位点,通过两次PCR获得目的片段。用PmaCI和BamHI双酶切,得到含有粘着末端的目的基因片断。②将纯化后的mAbA/B分别与载有NT4信号肽、TAT穿膜肽、6×His标签肽的pSSHG/NT4-TAT-His载体用DNA连接酶相连,构建重组质粒pSSHG/NT4-TAT-His-mAbA/B。③采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染293细胞,获得重组携带NT4-TAT-His-mAbA/B的AAV载体,RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。④rAAV-mAbA/B和空病毒载体分别感染Hela细胞,免疫细胞化学检测6×His表达情况,以此验证融合基因的表达。⑤rAAV-mAbA/B和Aβ42依次感染Hela细胞,观察细胞形态及细胞数量改变,初步探索细胞内抗体的作用。结果①mAbA/B基因经DNA测序与Genebank序列一致。②NT4-TAT-His-mAbA倍融合基因经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确,测序结果与实验设计的序列完全一致。③经酶切鉴定将融合基因成功插入至pSSHG载体中。④RT-PCR实时荧光定量测定病毒的滴度为3.4×109PFU/ml。⑤免疫组织化学染色检测到实验组Hela中6×His表达,而空病毒组未表达。⑥共聚焦显微镜下见rAAV-mAbA/B和Aβ42均表达,红色为抗Aβ42抗体结合Aβ42,绿色代表His抗体与细胞内抗体结合,它们在Hela的相同部位同时表达,且细胞内抗体组与正常对照组比较Hela细胞形态规则,数量基本未发生变化,而Aβ42加害组可见大量细胞碎片散落视野中,Hela细胞数目显著减少,形态不规则,呈多角性突变。说明细胞内抗体是通过在细胞内部与Aβ42结合发挥细胞保护作用的。结论①成功克隆了基因mAbA/B。②成功构建了具穿膜能力的"NT4-TAT-His-mAbA/B"融合基因。③成功构建了pssHG/NT4-TAT-His-mAbA/B重组腺相关病毒载体,并成功包装较高浓度的重组腺伴病毒。④重组携带NT4-TAT-His-mAb A/B的AAV载体能在Hela细胞中进行分泌表达且可与Aβ42高度结合。⑤重组携带NT4-TAT-His-mAb A/B的AAV,mAb A/B与Aβ42高效特异结合可以改善Aβ42损伤Hela细胞的形态。