多种临床疾病如创伤、出血、休克、脓毒症、重症急性胰腺炎中都可以发生肠道缺血再灌注(I/R)损伤。肠道I/R损伤导致肠粘膜屏障功能障碍,引起细菌与内毒素易位,后者是诱发全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)的重要原因。多个研究发现,肠道I/R损伤时都出现肠道分泌性免疫球蛋白A(sIgA)的减少。肠道sIgA是粘膜分泌物中最丰富的免疫球蛋白分型,其产生的部位是肠相关淋巴组织(GALT)。它能够高亲和力结合从而中和微生物毒素及致病菌,低亲和力结合共生菌以防止他们入侵粘膜表面,是肠道免疫屏障的第一道防线,对宿主的免疫稳态起重要作用。但是肠道I/R损伤如何导致肠道sIgA分泌减少的机理尚不清楚。发生肠道I/R损伤时如何防止肠道sIgA分泌减少也尚无确切的措施。n-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)是人体所需的必需脂肪酸,其主要活性成分为二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。文献报道n-3PUFAs具有调节Th1/Th2型细胞因子释放从而调节炎症反应的效应。关于n-3PUFAs与B细胞的研究主要集中在对免疫球蛋白分泌水平的影响。n-3PUFAs对I/R损伤时GALT中IgA分泌细胞的影响尚无相关报道。在本研究中,我们采用小鼠做为动物模型,观察I/R损伤时肠道sIgA水平变化及GALT中IgA分泌细胞的变化。在此基础上,我们观察I/R损伤时应用n-3PUFAs对肠道sIgA分泌的影响并探讨其机制,为I/R损伤时肠道粘膜屏障损害的保护性措施提供理论支持。全文共分为两个部分。第一部分 I/R损伤时肠道sIgA的变化及机理研究研究1.1小鼠肠道I/R模型的建立目的:建立小鼠肠道I/R损伤的模型,通过预实验确定缺血时间。方法:采用不同的肠系膜上动脉(SMA)夹闭时间(15min、30min、45min、60min、90min)将30只Balb/c小鼠随机分5组,观察小鼠5天生存率。用SPSS 13.0统计软件Kaplan-Meier法分析生存率,检验水准α = 0.05。结果:缺血45min、60min与90min的小鼠5天死亡率均超过50%;缺血30min的小鼠死亡率16.67%,与缺血超过30min组比较有显著差异(P<0.05),与缺血15min组(死亡率为0)无统计学差异(P>0.05)。结论:确定SMA夹闭30min方法为动物模型的肠道缺血时间,建立肠道I/R损伤模型。研究1.2 I/R损伤时肠道sIgA的变化目的:观察I/R损伤时肠道sIgA的变化,分析肠道sIgA与肠道粘膜损伤和远隔脏器细菌易位率的相关性。方法:48只小鼠随机分为6组,除假手术(sham)组外,采用研究1.1确定的缺血时间30min,在再灌注的不同时间(2h、6h、12h、24h、72h)处死小鼠并取材,检测远隔脏器(肝、脾、肠系膜淋巴结)细菌易位情况,做末段回肠组织病理学检查,ELISA法检测肠道sIgA水平变化。分析肠道sIgA与细菌易位率和末段回肠病理学评分的相关性。计量资料均以均数±标准差表示,用SPSS 13.0统计软件,多处理组与sham组比较用Dunnett-t检验,相关性分析采用双变量相关分析(Bivariate),检验水准α = 0.05。结果:远隔脏器肝、脾和肠系膜淋巴结组织匀浆涂布的培养基孵育后显示,在I/R6h即出现细菌易位,细菌易位率在I/R12h和I/R24h时最高(75%vs 0,P<0.01 vs sham组),菌落计数提示在I/R12h和I/R24h时菌落数最高;末段回肠病理学评分提示R6h与R12h绒毛损害严重(病理学评分3.0±0.89/2.83±0.75 vs 0.33±0.51,P<0.01vssham组),R24h绒毛增生,粗短,R72h绒毛形态恢复并接近正常。肠道sIgA水平随着再灌注时间的不同而改变,在I/R12h时水平最低,与 sham 组比较,差异有显著意义(15.17±2.32 vs 40.33±4.72,P<0.01)。肠道 sIgA水平与粘膜病理学评分和细菌易位率呈明显负相关(r2== 0.761/r2= 0.729,P<0.01)。结论:I/R时肠道sIgA水平下降,于I30min/R12h时水平最低。I/R时sIgA水平与肠粘膜损害密切相关。I/R时远隔脏器细菌易位率增加,与肠道sIgA水平呈明显负相关。提示肠粘膜屏障损伤时肠道sIgA水平下降导致了远隔脏器细菌易位。研究1.3 I/R损伤时GALT淋巴细胞中IgM+/IgA+B细胞亚群的变化目的:sIgA由IgA+B细胞分泌,IgA+B细胞需要在GALT中由IgM+B细胞经过类别转换而来。我们假设I/R时肠道sIgA水平下降是由于IgA+B细胞数目减少导致。本研究目的是观察肠道I/R损伤时GALT中IgM+IgA+B细胞亚群的变化。方法:提取GALT诱导部位派尔氏结(PPs)和效应部位固有层(LP)的淋巴细胞,采用流式细胞仪检测B细胞亚群改变。取含有PPs的末段回肠液氮速冻,切片做免疫荧光检测。计量资料均以均数±标准差表示,用SPSS 13.0统计软件,多处理组与sham组比较用Dunnett-t检验,检验水准α = 0.05。结果:随着I/R损伤的加重,PP结淋巴细胞(PPL)和固有层淋巴细胞(LPL)中的IgM+B220+细胞比例逐渐增多,而IgA+B220+细胞比例逐渐减少。PPL中IgM+B细胞比例最高点与IgA+B细胞比例最低点都在R6h(56.37±5.34 vs 34.15±4.34/3.08±0.33 vs 6.17±0.38,P<0.01 vs sham 组),LPL 中 IgM+B 细胞比例最高点与IgA+B细胞比例最低点在 R12h(5.97±0.42 vs 2.26±0.53/0.20±0.05 vs 1.44±0.20,P<0.01 vs sham 组)。结论:肠道I/R时GALT淋巴细胞中IgM+B细胞比例增加,IgA+B细胞比例下降。提示I/R时IgA+B细胞数目减少导致了肠道sIgA水平的下降。研究1.4I/R损伤时GALT淋巴细胞中AID mRNA表达的变化目的:研究1.3结果显示肠道I/R时GALT淋巴细胞中IgA+B细胞比例下降,IgM+B细胞比例增加。IgM+B细胞向IgA+B细胞转化过程中需要一个DNA编码酶——活化诱导胞苷脱氨酶(AID)的作用,这个转换过程在GALT诱导部位和效应部位的B细胞中都可以发生。我们假设I/R时GALT中IgA+B细胞比例下降是由于GALT的淋巴细胞中AID的减少导致的,因此本研究目的是探讨I/R时GALT淋巴细胞中这个类别转换酶AID mRNA的表达变化。方法:24只小鼠随机分为sham组和I/R(R=12h)组,应用研究1.3中的方法获取PPL和LPL,分别提取PPL和LPL的总RNA,通过RT-PCR分析PPL和LPL中B细胞类别转换酶——AID mRNA的表达变化,参照GAPDH mRNA的表达做灰度分析。数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 13.0统计软件,两样本间均数比较用独立样本T检验,检验水准α = 0.05。结果:PPL与LPL中AID mRNA表达的RT-PCR分析结果显示,I/R损伤时AID mRNA 表达显著下降(PPL:27.0±3.16vs 50.75±4.03,LPL:14.50±2.08vs 34.25±3.30,P<0.01 vs sham 组)。结论:I/R损伤导致GALT的PPL和LPL中的AID mRNA表达下降。提示I/R时GALT中IgA+B细胞比例下降是由于GALT的淋巴细胞中AID的减少导致的。第一部分小结I/R损伤时GALT淋巴细胞中AID mRNA表达下降,导致IgM+B细胞不能有效转换为IgA+B细胞,肠道中分泌IgA的B细胞减少,肠道sIgA水平下降,最终导致细菌易位的发生。第二部分n-3PUFAs对I/R时肠道slgA分泌的影响及机制研究研究2.1 n-3PUFAs对I/R时肠道slgA及其分泌细胞的影响目的:观察应用n-3PUFAs对I/R时肠道slgA及其分泌细胞的影响。方法:Balb/c小鼠36只,随机分sham组、I/R组和鱼油(FO)组(n-3PUFAs干预)。在再灌注开始,FO组实验动物应用10%鱼油脂肪乳(Omegaven,尤文),1g(10ml)/Kg,自尾静脉缓慢推注。sham组和I/R组尾静脉推注同等容量的生理盐水。在R12h处死小鼠取材,分别检测肝、脾、肠系膜淋巴结细菌易位率、肠道sIgA水平测定(ELISA),提取PPL和LPL做B细胞亚群流式分析。所有计量资料均以均数±标准差表示,将数据用SPSS 13.0统计软件作多组间单向方差分析(LSD法),检验水准α = 0.05。结果:与sham组比较,I/R组远隔脏器细菌易位率明显增加(75%vs 0,P<0.01),FO组细菌易位率较I/R组明显降低,(12.5%vs75%,P<0.01)。肠道sIgA水平在I/R时显著下降,FO组肠道sIgA水平显著恢复(28.50±4.32 vs 15.17±2.32,P<0.01 vsI/R 组)。PPL/LPL 流式分析显示,I/R 时 PPL/LPL 中的IgA+B2aO+细胞比例显著降低,而IgM+B220+细胞比例显著升高。与I/R组比较,FO组PPL和LPL中的IgA+B220+细胞比例明显增加,而IgM+B220+细胞比例下降(PPL:5.17±0.42 vs 3.90±0.38/42.87±4.82 vs 53.33±4.65;LPL:0.61±0.06 vs 0.20±0.05/4.08±0.45 vs 5.977±0.42;P<0.05)。结论:I/R损伤时应用n-3PUFAs能够增加GALT淋巴细胞中IgA+B细胞比例,增加肠道sIgA水平,减少细菌易位的发生。本研究结果提示n-3PUFAs对于I/R导致的肠道sIgA水平及分泌细胞方面的损害有保护作用。研究2.2 n-3PUFAs对I/R损伤保护作用的机制研究目的:GALT中的B细胞需要由IgM+B细胞转换为IgA+B细胞并进一步分化为IgA+浆细胞来完成分泌IgA的使命。AID是唯一参与B细胞类别转换的酶。在LP发生的非T细胞依赖的B细胞类别转换过程中,需要两个特殊分子即B细胞活化分子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。我们假设n-3PUFAs通过改变GALT淋巴细胞中AID mRNA的表达和LP中BAFF/APRIL两个分子蛋白表达来影响肠道sIgA的分泌,本研究中我们验证这个假设。此外,有研究证实I/R损伤导致GALT细胞凋亡也是导致肠道sIgA水平下降的原因,我们研究n-3PUFAs是否对GALT细胞凋亡有影响,进一步探讨n-3PUFAs对I/R损伤保护作用的机制。方法:动物模型制作、分组及干预同研究2.1。在R12h处死小鼠取材,提取PPL用流式细胞仪进行凋亡检测。分别检测PPL/LPL中AID mRNA的表达变化(RT-PCR)及肠粘膜组织中BAFF/APRIL蛋白表达的变化(western blot)。所有计量资料均以均数±标准差表示,将数据用SPSS 13.0统计软件作多组间单向方差分析(LSD法),检验水准α = 0.05。结果:与 sham 组比较,PPL 凋亡比例增加(17.69±3.04 vs 1.63±0.25,P<0.01);I/R组 PPL/LPL 中 AID mRNA 的表达下调(27.0±3.16 vs 50.75±4.03/14.50±2.08 vs 34.25±3.30,P<0.01);肠粘膜组织中 BAFF/APRIL 蛋白表达下调(24.50±2.65vs 49.75±5.56/16.50±2.08 vs 43.57±5.45,P<0.01)。FO组PPL凋亡比例减小,与I/R 组比较显著差异(10.44±1.12vs 17.69±3.04,P<0.05);PPL/LPL 中 AIDmRNA的表达较 I/R 组增强(40.50±2.08 vs 27.0±3.16/28.0±2.94 vs 14.50±2.08,P<0.05);肠粘膜组织中BAFF/APRIL蛋白表达均较I/R组增强(37.5O±5.20 vs 24.50±2.65/34.0±3.92vs16.50±2.08,P<0.05)。结论:I/R时应用n-3PUFAs能够减少PPL凋亡,增强GALT淋巴细胞中AID mRNA的表达,增加肠粘膜组织中BAFF和APRIL含量。本研究提示n-3PUFAs对I/R损伤的保护机制可能是:1、降低I/R损伤时GALT中诱导部位PP结淋巴细胞的凋亡;2、增加GALT淋巴细胞中类别转换唯一参与酶AID mRNA的表达,促进B细胞由IgM+向IgA+的类别转换;3、增加肠粘膜组织中BAFF和APRIL含量,促进IgA的分泌。n-3PUFAs通过以上机制预防了 I/R损伤时肠道sIgA水平的下降,从而发挥保护肠屏障抑制细菌易位的作用。本课题研究通过建立小鼠肠道I/R损伤模型,观察了 I/R时肠道sIgA水平的变化及其机理,探讨了 n-3PUFAs对I/R时肠道sIgA及其分泌细胞的影响和可能的机制,初步得出以下结论:1.肠道I/R导致sIgA水平下降,肠道sIgA水平与肠粘膜损害程度和细菌易位率密切相关。2.肠道I/R时GALT淋巴细胞中AID mRNA的表达下调,IgA+B细胞比例减少,肠道sIgA水平下降。提示I/R时肠道sIgA水平下降的机理可能是,参与IgM+B细胞向IgA+B细胞类别转换的酶AID的减少,导致IgM+B细胞不能有效转换为IgA+B细胞,导致肠道sIgA水平下降。3.n-3PUFAs增加I/R时肠道sIgA水平,有效降低I/R时细菌易位的发生。4.I/R时应用n-3PUFAs,能够增强GALT淋巴细胞中AID mRNA的表达,增加肠粘膜组织中BAFF和APRIL的蛋白含量,增加GALT中IgA+B细胞比例增加肠道sIgA水平。提示n-3PUFAs保护I/R损伤的机制可能是增加GALT淋巴细胞中AID mRNA的表达,促进IgM+B细胞向IgA+B细胞的转换;增加肠粘膜组织中BAFF和APRIL的蛋白含量,促进IgA的分泌。5.n-3PUFAs还能够减少PP结淋巴细胞的凋亡,防止I/R损伤导致的GALT萎缩。这可能也是n-3PUFAs增加肠道sIgA水平的机制之一。