糖尿病是一种常见多发的慢性内分泌代谢紊乱综合征，由于体内胰岛素缺乏或相对不足而引起的组织器官的代谢异常功能障碍，并最终可导致一系列合并症出现，并由此导致截肢、失明甚至死亡等严重后果。阐明糖尿病发病过程中血管功能损害的产生机制，将为寻找药物作用的新靶点和有效药物的研制具有重要的科学意义和应用前景。 第1章：糖尿病大鼠胸主动脉平滑肌细胞Ca<2+>运动的变化新鲜分离16周糖尿病大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，采用Fluo--3/AM荧光标记的方法动态监测平滑肌细胞胞浆Ca<2+>运动的变化。探讨糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的Ca<2+>调控机制的异常变化。结果显示： 1.Wistar雄性大鼠，体重为228g±13 g(n=90)，随机分为正常对照组和糖尿病模型组。建立糖尿病模型72小时后，糖尿病组血糖明显升高(糖尿病组：23.3±0.5 mmol/L，vs正常组：4.8±0.06 mmol/L，n=45，P<0.001)，16周后血糖仍缓慢升高，血糖分别为(糖尿病组：26.1±0.6 mmol/L，n=40 vs 正常组：5.0±0.06 mmol/L，n=45，P<0.001)。16周时的体重糖尿病组比正常组降低，分别为(糖尿病组：302g±6g，n=40 vs正常组：481g±4g，n=45，P<0.001)，并明显出现多饮、多食、多尿和生长迟缓等症状。而正常对照组大鼠体重逐渐增加，从(234±2)g增加到(481±4)g，且血糖无显著性变化。 2. 首先观察静息状态下，平滑肌细胞胞浆Ca<2+>的荧光值。16周的糖尿病大鼠和正常组相比(正常组：1995±184，n=7 vs糖尿病组：1565±173，n=8；P>0.05)，两组之间胞浆静息Ca<2+>荧光值无显著性差异。 3. 16周的糖尿病大鼠KCI触发的胞浆Ca<2+>变化与正常对照组相比，两组之间无显著性差异(正常组：0.59±0.09，n=7 vs糖尿病组：0.65±0.08，n=8；P>0.05)。结果提示糖尿病主动脉血管平滑肌细胞电压依赖性Ca<2+>运动无显著性变化。 4.与正常组相比，糖尿病组Phenylephrine(Phe)触发的胞浆Ca<2+>变化降低39％，分别为(正常组：0.46±0.06，n=7 vs糖尿病组：0.28±0.02，n=6；P<0.05)，两组之间有显著性差异。结果提示糖尿病时血管平滑肌细胞Phe介导的钙运动显著性降低。 5.CPA是肌浆网上Ca<2+>泵特异性抑制剂，16周的糖尿病病组与正常组相比，CPA触发的Ca<2+>释放和Ca<2+>内流都降低显著性降低。CPA引起的Ca<2+>释放为(正常组：0.45±0.04，n=6 vs糖尿病组：0.28±0.01，n=6；P<0.05)，Ca<2+>内流为(正常组：0.57±0.05，n=6 vs糖尿病组：0.37±0.01，n=6；P<0.05 )，结果提示糖尿病大鼠经SOCC介导的Ca<2+>内流和Ca<2+>释放均是显著性降低。 6.Phe可耗竭IP3敏感的Ca<2+>池，16周的糖尿病病组与正常组相比，Phe触发的Ca<2+>释放和Ca<2+>内流都降低显著性降低。Phe引起的Ca<2+>释放为(正常组：0.42±0.04，n=7 vs糖尿病组：0.24±0.04，n=6；P<0.05)；Ca<2+>内流为(正常组：0.53±0.04，n=7 vs糖尿病组：0.34±0.07，n=6；P<0.05)，结果提示糖尿病大鼠平滑肌细胞IP<,3>敏感的钙池的Ca<2+>释放和Ca<2+>内流均是显著性降低。 7.Rynaodine(Ry)可耗竭Ry敏感的Ca<2+>池，16周的糖尿病病组与正常组相比，Ry触发的Ca<2+>释放和Ca<2+>内流都显著性降低。Ry引起的Ca<2+>释放为(正常组：0.26±0.07，n=9 vs糖尿病组：0.06±0.01，n=5；P<0.05)，Ca<2+>内流为(正常组：0.27±0.03，n=9 vs糖尿病组：0.15±0.02，n--5；P<0.05)。结果提示糖尿病大鼠平滑肌细胞Ry敏感钙池的Ca<2+>释放和Ca<2+>内流均是显著性降低。小结： 1.糖尿病大鼠主动脉血管平滑肌细胞的静息Ca<2+>及电压依赖性Ca<2+>运动无变化；而Phe介导的胞内Ca<2+>升高显著降低。 2.糖尿病大鼠主动脉血管平滑肌细胞的Ca<2+>池操纵性Ca<2+>内流降低，IP<,3>途径Ca<2+>释放和Ca<2+>内流均呈显著降低，同样ryanodine途径的Ca<2+>释放和Ca<2+>内流也呈显著降低。说明糖尿病血管平滑肌细胞Ca<2+>池功能紊乱。 第2章糖尿病大鼠主动脉平滑肌IP<,3>和ryllnoldine蛋白的表达为了进一步明确IP<,3>和Ry受体在蛋白水平上的变化是否与其功能学相一致，我们采用Westem blot方法检测了糖尿病平滑肌的IP<,3>和Ry受体蛋白水平的表达。结果显示： 1.IP<,3>受体蛋白表达：16周糖尿病大鼠的胸主动脉血管平滑肌层的IP<,3>受体蛋白表达与对照组相比降低31.8％±7.7％，两组之间相比有显著性差异(n=6，P<0.05)。本实验进一步从蛋白水平表明血管平滑肌细胞的IP<,3>受体通道的异常改变。 2.Ry受体蛋白表达：为进一步观察Ry途径的Ca<2+>释放减少的机制，我们检测了16周的糖尿病大鼠的胸主动脉血管平滑肌层的Ry受体蛋白表达，结果发现糖尿病组的Ry受体蛋白与对照组与对照组相比降低69.2％±8.4％，两组之间相比有显著性差异(n=7，P<0.05)。结果表明糖尿病时血管平滑肌细胞上Ry受体蛋白水平显著性降低。小结： 1.主动脉平滑肌层有IP<,3>受体蛋的表达，分子量约为260kDa；同时表达ryanodine受体蛋白，分子量约为500 kDa。 2.糖尿病时IP<,3>受体和ryanodine受体在平滑肌上蛋白表达下调。 为了进一步明确糖尿病大鼠IP<,3>和Ry敏感Ca<2+>池的异常变化对血管平滑肌收缩的影响，我们采用血管环收缩实验来分别观察这两部分Ca<2+>池所触发的Ca<2+>释放引起的相应收缩的变化。结果如下； 1.对Phe的收缩反应： (1)首先，我们在有Ca<2+>的Krebs液中，浓度依赖性的给予Phe(10<-8>，3×10<-8>，10<-7>，3×10<-7>，10<-6>，3×10<-6>，10<-5>)mol/1观察16周的糖尿病和正常组的收缩反应。糖尿病病组的最大收缩张力比正常组降低36％，两组之间有显著性差异(正常组：336.95±24.23 vs糖尿病组：215.85±25.91，n=7,P<0.01)。在低浓度时(10<-8>和3×10<-8>)mol/1，两组没有显著性差异。但是到较高浓度(≥10<-8>mol/l)时，两组相比有显著性差异。(2)为观察IP<,3>途径的Ca<2+>释放引起的收缩反应，我们在无Ca<2+>等渗透压状态下，加入Phe(10 μM)，然后再复Ca<2+>。从IP3途径的Ca<2+>释放引起的收缩反应，糖尿病组比正常对照组降低41％(正常组：183.31±14.81 vs糖尿病组：108.44±13.89，n=7；P<0.01)，两组之间有显著性差异。随后复Ca<2+>，复Ca<2+>后的收缩也是糖尿病病组比正常对照组降低35.9％，分别为(正常组：318.14±28.02 vs糖尿病组：203.77±37.41，n=7；P<0.05)，两组之间有显著性差异。 2.对ryanodine和咖啡因的收缩反应：为进～步观察Ry途径的释放引起的收缩反应，我们也同样在无Ca<2+>等渗透压状态下，加入ryanodine(1 μ M)后，发现无收缩反应。我们继续加大ryanodine的剂量(10-100 μ M)，在正常和糖尿病组均未观察到收缩现象。因咖啡因与其作用的Ca<2+>池的受体相同，我们又加入20 mmol/1的咖啡因，我们仍未观察到血管环的收缩。 最后，在有Ca<2+>液状态下加入ryanodine，在16个血管环中仅发现一个血管环有1.0 g的收缩张力。因此我们认为16周的wistar大鼠Ry受体途径的Ca<2+>释放触发收缩的信号很微弱，在本实验条件下不易检测。小结： 1． 16周的糖尿病大鼠主动脉的Phe触发的收缩反应显著降低，IP<,3>途径的Ca<2+>释放所触发的收缩反应显著降低。 2． 16周大鼠的Ry受体途径的Ca<2+>释放触发主动脉平滑肌的收缩作用微弱。