论文部分内容阅读
在植物体内,逆境相关基因的表达在转录水平上与转录因子与基因的顺式作用元件相互作用密切相关。乙烯响应因子(Ethylene response factors, ERF)作为重要的转录因子可以调控多种植物逆境相关基因的表达。而植物防御素(PDF)基因是植物响应病虫害侵袭的重要相关基因。本文通过对这两个基因启动子的研究,推断两个基因在葡萄抗逆响应途径中的表达模式,对于了解葡萄对逆境的抵抗机理有着重要的意义。本研究利用PCR扩增获得欧洲葡萄(Vitis vinifera)的ERF3b基因和PDF1.2基因启动子序列,并利用PLACE和PlantCARE软件分析得到的两个基因的启动子序列。在VvERF3b基因启动子序列中发现多种与植物激素相关的顺式作用元件:ABRE元件、ASF1元件、DPBF元件、DRE元件、ERE元件、GCC元件、W-box和TCA元件,而在VvPDF1.2基因启动子内发现多种与植物逆境响应相关的顺式作用元件:W-box、TGA元件、TC-rich元件、TATC元件、ERE元件、SEBF元件和MYBGAHV元件。按照VvERF3b基因启动子顺式作用元件的分析结果设计了6个上游启动子引物分别和一个下游启动子引物配对,利用PCR扩增获得6条起始密码上游长度不同的启动子片段P1P6,通过酶切、纯化、连接,将6条VvERF3b基因5’缺失启动子序列代替原载体的8×GCC增强子和35S启动子插入pGCC载体中,与LUC报告基因连接构建6个植物表达载体:VvERF3b-P1VvERF3b-P6。使用PEG-Ca2+介导法介导重组载体转染拟南芥原生质体,用瞬时表达方法检测LUC表达量,结果表明VvERF3b基因启动子中从-1047bp到-585bp区域对于下游基因的表达有激活的作用,而从-1324bp到-1047bp区域可能存在两个以上对下游基因的表达起抑制作用的基序,用来抑制基因本身的表达。鉴于目前市场中没有LUC植物表达载体,该文使用PCR扩增获得LUC基因片段,通过酶切、纯化、连接等手段将LUC基因片段代替pBI221载体的GUS基因片段在35S启动子驱动下表达,构建了具有多克隆位点(MCS)的LUC植物表达载体。