慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是指各种原因引起的慢性肾脏结构紊乱和功能障碍持续超过3个月。一旦诊断,若不能及时发现并采取有效的干预措施,最终将发展为终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)。近年来CKD的发病率和死亡率均逐年增加,流行病学调查显示,CKD患病率约为13.4%;据世界卫生组织估计,到2030年CKD的死亡率将上升至14/10万人口,已成为全球重要的公共健康问题之一。肾脏纤维化是CKD发生发展的重要病理特点,是CKD发展至ESRD的必经途径。病理上,肾脏纤维化以肾小球硬化、肾小管间质纤维化、肾血管硬化以及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积为主要特征。肾小管间质纤维化是肾脏纤维化的重要组成部分,其涉及小管上皮细胞损伤、炎症反应、氧化应激等多个方面,受多种信号通路及关键分子的共同影响。在肾小管间质纤维化过程中,ECM过度沉积及肾小管上皮细胞的上皮-间质转化(EMT)起到至关重要的作用。如何控制和延缓肾小管上皮细胞EMT、减少ECM的沉积,成为减缓CKD进展的关键。肾毒性药物、缺血、缺氧、感染等多种原因均可导致CKD的发生与发展。慢性缺氧是导致肾脏损伤的最常见因素之一,尽管肾脏可得到25%的心输出量,但是肾脏组织中的氧气张力却很低,这使得肾脏对氧气输送的变化相对敏感,易受到缺氧损伤。慢性缺氧是各种肾脏疾病的关键病理状态,应用血氧水平依赖性磁共振成像可以观察到CKD患者的肾脏处于低氧状态。根据最新研究进展显示,在CKD中,肾小管间质发生低氧的病理机制有多种:首先,肾小球硬化导致下游肾小管周围毛细血管的数量及血流量减少;其次,由于纤维化引起的肾小管毛细血管变形和丢失进一步减少了血液灌注;再次,ECM沉积扩大了毛细血管和肾小管之间的距离,降低了氧气扩散的效率。随着疾病的不断进展最终将导致肾脏缺氧状态持续发生。反过来,肾脏持续缺氧又进一步促进肾脏纤维化,最终导致疾病进展恶化,如此形成恶性循环。肾小管上皮细胞在肾间质纤维化的发生发展过程具有重要作用。当肾小管上皮细胞暴露于低氧环境时,会发生复杂的应答反应,激活多条在肾脏纤维化过程中起到关键作用的信号通路,从而使细胞内间充质标志物表达水平明显增加,促进ECM积累抑制其降解,进而促进肾小管间质纤维化的发展。因此,我们运用低氧孵箱模拟肾脏低氧环境来刺激肾小管上皮细胞,探讨低氧诱导的肾小管上皮细胞损伤的分子机制,从而为各种原因导致的低氧诱导的肾脏纤维化提供研究依据。N-Myc下游调控基因2(NDRG2)属于NDRG家族,人类NDRG2基因位于14q11.1-11.2染色体上,在体内组织广泛表达,可参与众多生物学功能,通过调控多种信号通路参与肿瘤性、纤维化性、炎症性等多种疾病的发生发展。有研究显示,过表达NDRG2可以减轻高糖诱导的人腹膜间皮细胞表型转化;同时,NDRG2可减少二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝脏纤维化模型中ECM沉积、进而减轻肝纤维化,并改善肝功能。据此,我们推测其可能会参与低氧诱导的肾脏纤维化,并在其中发挥关键作用。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,又称之为蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),其可通过Thr308、Ser473位点磷酸化而激活,活化后参与多种生物学过程,可诱导EMT参与多种细胞因子的致纤维化过程。研究显示,磷酸化的AKT(p-AKT)在肾脏纤维化过程中高表达,参与低氧诱导的肾小管上皮细胞EMT。有研究证实NDRG2可以通过调控AKT的活化参与调节食管癌的侵袭、转移、EMT;NDRG2过表达可抑制PI3K/AKT信号通路,从而抑制口腔鳞状细胞癌的EMT。基于目前研究,我们推测NDRG2可能通过靶向AKT参与介导肾间质纤维化的进程。本研究中我们以肾小管上皮细胞为研究对象,在低氧环境下观察细胞NDRG2、AKT、p-AKT、EMT相关指标及I型胶原蛋白(Collagen-I)、纤维连接蛋白(Fibronectin)的表达变化情况,探讨NDRG2是否通过调控AKT磷酸化水平参与肾小管上皮细胞损伤诱导EMT而加速肾脏纤维化的进程,为临床治疗CKD提供新的途径及靶点。第一部分明确低氧条件下NDRG2在肾小管上皮细胞的表达改变及其影响目的:1.明确低氧环境是否导致肾小管上皮细胞EMT及Collagen-I、Fibronectin表达水平的改变。2.明确低氧环境下NDRG2的表达水平改变并进一步探讨NDRG2对低氧诱导的肾小管上皮细胞EMT及Collagen-I、Fibronectin表达水平的影响。方法:1.细胞培养:取肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelium cells,HK2)置于含10%胎牛血清,1%青链霉素的DMEM高糖培养基中,并于37℃,5%CO2的细胞孵箱中连续传代培养。2.检测低氧刺激后肾小管上皮细胞中NDRG2的表达变化:(①37℃,5%CO2孵箱中培养肾小管上皮细胞,当该细胞密度达40%-50%时更换新的培养基,然后置于37℃,1%O2的低氧孵箱中建立低氧刺激的时间梯度,并根据实验结果选取合适的低氧刺激时间作为后续研究的观察时间点。②运用western blot检测NDRG2蛋白表达水平的变化。3.检测低氧刺激后肾小管上皮细胞损伤相关指标的变化:筛选出最合适的低氧刺激作用时间,运用western blot、real time PCR以及细胞免疫荧光等方法检测低氧刺激后细胞内间充质细胞样表型标志物α-SMA、N-cadherin、Vimentin与上皮标志物E-cadherin及Fibronectin、Collagen-I表达水平的变化。4.检测调控NDRG2对低氧刺激后肾小管上皮细胞损伤相关指标的影响:①NDRG2过表达慢病毒载体、空白对照病毒载体、NDRG2 shRNA慢病毒载体及乱序对照病毒载体的构建、转染,western blot检测NDRG2在转染前后蛋白表达水平的变化。②western blot检测过表达NDRG2及敲除NDRG2后,低氧刺激后肾小管上皮细胞间充质细胞样表型标志物α-SMA、N-cadherin、Vimentin与上皮标志物E-cadherin及Fibronectin、Collagen-I表达水平的变化。结果:1.低氧刺激肾小管上皮细胞24、48小时后,NDRG2表达水平明显减少(p<0.05)。2.低氧刺激肾小管上皮细胞24、48小时后,α-SMA、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Collagen-I表达水平明显增加(p<0.05);E-cadherin表达水平明显降低(p<0.05)。3.转染NDRG2过表达慢病毒载体后,肾小管上皮细胞NDRG2的表达水平显著增加(p<0.01);较低氧组,过表达NDRG2显著降低了低刺激氧48小时后肾小管上皮细胞α-SMA、N-cadherin、Vimentin以及Fibronectin、Collagen-I的表达水平(p<0.05)、增加了E-cadherin表达的水平(p<0.05);Null组各项指标表达水平无明显变化(p>0.05)。4.转染sh NDRG2慢病毒载体后,肾小管上皮细胞NDRG2的表达水平明显降低(p<0.01);较低氧组,敲除NDRG2显著升高了低刺激氧48小时后细胞内α-SMA、N-cadherin、Vimentin以及Fibronectin、Collagen-I的表达水平(p<0.05)、降低了E-cadherin表达的水平(p<0.05);Scramble组各项指标表达水平无明显变化(p>0.05)。结论:1.低氧环境可以诱导肾小管上皮细胞损伤发生EMT并导致Fibronectin、Collagen-I表达水平增加。2.低氧环境下,肾小管上皮细胞NDRG2的表达水平降低,NDRG2参与低氧条件诱导的肾小管上皮细胞EMT并调节Fibronectin、Collagen-I的表达。第二部分NDRG2通过调控AKT的磷酸化水平介导低氧条件下肾小管上皮细胞损伤的发生目的:明确NDRG2能否通过靶向AKT介导低氧条件下肾小管上皮细胞的EMT及其对Fibronectin、Collagen-I表达的影响。方法:1.运用western blot检测肾小管上皮细胞在低氧刺激后AKT、p-AKT的表达水平变化。2.AKT小干扰RNA、空白对照小干扰RNA的构建、转染以及基因干扰效率的鉴定:利用real time PCR及western blot分别在mRNA与蛋白水平检测转染前后肾小管上皮细胞AKT表达水平的变化,并鉴定基因干扰效率。3.肾小管上皮细胞NDRG2与AKT的相互作用:(①分别转染NDRG2过表达慢病毒及NDRG2 shRNA慢病毒,western blot检测AKT及p-AKT的表达水平改变;②肾小管上皮细胞共转染NDRG2 shRNA慢病毒与AKT小干扰RNA,western blot、real time PCR检测低氧刺激48小时后共转染细胞内α-SMA、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin及Fibronectin、Collagen-I的表达变化。1.低氧刺激肾小管上皮细胞后,AKT的表达水平无明显变化(p>0.05)、p-AKT的表达水平明显升高(p<0.05)。结果:2.转染AKT小干扰RNA,AKT的表达量显著降低(p<0.05)。低氧刺激48小时后,较低氧组,si-AKT组肾小管上皮细胞E-cadherin表达水平增加,α-SMA、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Collagen-I表达水平减少(p<0.05);NC组各项指标表达水平无明显变化(p>0.05)。3.低氧刺激48小时后,较对照组,转染NDRG2过表达慢病载体的肾小管上皮细胞内AKT的表达水平无明显变化(p>0.05),p-AKT的表达水平明显降低(p<0.05);低氧刺激48小时后,较对照组,转染NDRG2shRNA慢病载体的肾小管上皮细胞内AKT的表达水平无明显变化(p>0.05),p-AKT的表达水平明显升高(p<0.05)。4.低氧刺激48小时后,较NDRG2 shRNA组,共转染组肾小管上皮细胞内E-cadherin表达水平明显增加;α-SMA、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Collagen-I的表达水平明显降低。结论:1.AKT参与介导低氧诱导的肾小管上皮细胞EMT并调节Fibronectin、Collagen-I的表达。2.NDRG2通过调控AKT的磷酸化水平参与低氧诱导的肾小管上皮细胞EMT并调节Fibronectin、Collagen-I的表达。