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第一部分SSc患者和正常人皮肤Fb克隆分离及胶原合成异质性克隆的筛选目的分离系统性硬皮病(Systemic scleroderma,SSc)患者和正常人皮肤成纤维细胞(Fibroblast,Fb)克隆,筛选出胶原合成异质性克隆。方法以组织块培养法进行SSc患者和正常人皮肤Fb原代培养,采用免疫组化方法进行细胞鉴定,以改良的有限稀释法分离、培养Fb克隆,通过原位杂交方法检测Fb克隆Ⅰ型前胶原α1链(COL1A1)mRNA的表达。结果建立5个SSc患者皮肤Fb细胞系和4个正常人皮肤Fb细胞系,经免疫组化法鉴定培养的细胞为Fb。经分离、培养共获得68个Fb克隆(克隆第四代),包括SSc患者36个Fb克隆和正常人32个Fb克隆。原位杂交法显示SSc组Fb克隆COL1A1mRNA的平均OD值(6.636±2.480)高于正常对照组(3.693±2.007),t=3.690,P=0.001。通过聚类分析将所有克隆的平均OD值分为高、中、低三组。SSc组和正常对照组Fb克隆高、中、低三组的总体构成比不同(P=0.005)。SSc组COL1A1mRNA高表达组克隆的比例高于正常对照组。在此基础上,本课题组另一成员对Fb克隆Ⅰ型前胶原蛋白(免疫印迹和ELISA法)和COL1A1、COL3A1mRNA(实时定量RT-PCR,Taqman探针法)的测定结果表明:(1)SSc组Fb克隆COL1A1mRNA与COL3A1mRNA水平的异质性较正常对照组大;(2)Fb克隆Ⅰ型前胶原蛋白表达与其mRNA水平呈正相关;(3)Fb克隆的COL1A1mRNA水平与COL3A1mRNA水平呈正相关。并将Fb克隆分为高、中、低胶原合成组。SSc组高胶原合成克隆的比例及其平均胶原合成量高于正常对照组高胶原合成克隆。结论SSc患者皮肤Fb高胶原合成克隆的比例及其胶原合成增高的幅度大于正常人。第二部分SSc患者和正常人胶原合成异质性Fb克隆的胶原基因转录特性研究目的了解SSc患者和正常人胶原合成异质性Fb克隆的胶原基因转录特性。方法构建含人COL1A1和COL3A1基因启动子片段的重组质粒,采用瞬时转染法、双荧光素酶报告基因检测技术测定COL1A1和COL3A1基因启动子在胶原合成异质性Fb克隆中的活性。通过染色质免疫沉淀(ChIP)分析法结合定量PCR法检测转录因子Sp1与不同Fb克隆COL1A1基因近端启动区的结合活性。结果经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定,所有重组质粒构建正确。经瞬时转染、报告基因测活发现COL1A1-174bp～+42bp、COL3A1-96bp～+16bp在不同Fb克隆中具有相对最高或较高的活性,并且其活性分别与Fb克隆Ⅰ型/Ⅲ型前胶原表达呈正相关。ChIP、定量PCR结果显示,Sp1与高胶原合成克隆COL1A1近端启动区-174bp～+42bp的结合活性高于低胶原合成克隆(P＜0.05),这种差异在SSc组较正常对照组更为明显(F=24.569,p=0.000)。结论SSc患者高胶原合成Fb克隆的Ⅰ型、Ⅲ型前胶原基因在转录水平即被激活;转录因子Sp1可能参与上调SSc患者高胶原合成Fb克隆COL1A1-174bp～+42bp启动片段的活性。第三部分细胞因子和丹参对SSc患者胶原合成异质性Fb克隆胶原基因转录的调控目的研究细胞因子、丹参及其单体对SSc患者胶原合成异质性Fb克隆Ⅰ型、Ⅲ型前胶原基因转录的影响。方法以瞬时转染方法将含有人COL1A1-174bp～+42bp、COL3A1-96bp～+16bp启动片段的重组质粒转染SSc患者和正常人胶原合成异质性Fb克隆,施加细胞因子、丹参及其单体干预48h后,通过双荧光素酶报告基因检测技术测定COL1A1和COL3A1近端启动区的活性。结果TGF-β1(5ng/mL)、CTGF(20ng/mL)上调COL1A1、COL3A1近端启动区在SSc患者和正常人Fb克隆中的活性,其中CTGF在SSc患者优先上调COL3A1近端启动区在低胶原合成Fb克隆中的活性。丹参注射液(1mg/mL)、丹参酮ⅡA(5μg/mL)抑制COL1A1、COL3A1近端启动区在SSc患者和正常人Fb克隆中的活性,并且优先下调两者在SSc患者高胶原合成Fb克隆中的活性;原儿茶醛(5μg/mL)和丹酚酸B(5μg/mL)分别选择性抑制COL1A1和COL3A1近端启动区在Fb克隆中的活性。未发现IFN-γ(100ng/mL)、丹参素钠(20μg/mL)抑制COL1A1和COL3A1近端启动区在Fb克隆中的活性。结论细胞因子之间可能构成复杂的转录调控网络,参与激活SSc患者Fb胶原基因转录。丹参及其部分单体可抑制SSc患者胶原合成异质性Fb克隆Ⅰ型、Ⅲ型前胶原基因转录,但作用不尽相同。