本课题主要选用人乳腺癌组织和细胞系，通过体内、外一系列实验研究USP37对乳腺癌干细胞的作用，及其对乳腺癌细胞迁移和侵袭等生物学行为及顺铂敏感性情况，进一步研究USP37与Hedgehog信号通路的关系及有关的作用机制。　　第一部分 去泛素化酶USP37在乳腺癌、乳腺癌干细胞中的表达及其相关生物信息学分析　　目的:探讨USP37在乳腺癌组织及细胞系中的表达，及其与乳腺癌分型、患者预后关系。通过基因富集分析探讨USP37与相关信号通路的关系。　　方法:通过免疫组织化学染色的方法，检测USP37在乳腺癌组织及其癌旁的正常组织中的蛋白表达;同时，通过免疫印迹法检测USP37在乳腺癌细胞系中的表达量。其次，通过TCGA数据库分析USP37 mRNA水平在浸润性乳腺癌患者分布及其患者总体生存率。基因富集分析预测差异表达USP37与信号通路的相关性。通过免疫磁珠分选出富含乳腺癌非干/干细胞的亚群，通过实时荧光定量PCR实验及细胞免疫荧光实验检测USP37在乳腺癌非干/干细胞中的表达。通过免疫印迹实验检测USP37在贴壁细胞及对应的乳腺球的表达差异。　　结果:通过对TCGA表达谱数据分析USP37在乳腺癌患者表达差异，结果显示，相对于正常的乳腺组织样本(n=29)，USP37 mRNA水平在乳腺癌组织(n=517)中较正常组明显升高（***P＜0.0001）。USP37在Luminal B型乳腺癌中高表达(***P＜0.0001)。低表达USP37的乳腺癌患者组的预后优于高表达USP37组。　　结论:1.USP37的mRNA表达量在乳腺癌组织中显著升高，并且高表达的USP37与乳腺癌患者预后不良密切相关。USP37在乳腺癌组织及细胞系中表达量显著升高，提示在乳腺癌中USP37是具有癌性相关作用的基因。2.高表达的USP37与细胞增殖、转移、细胞抗凋亡呈正相关。3.USP37在乳腺癌干细胞中显著高表达，提示USP37可能参与影响乳腺癌干细胞的特性。　　第二部分 体外实验探讨USP37对乳腺癌细胞干性的影响　　目的:通过体外实验探讨USP37是否参与调控乳腺癌细胞干性、上皮间质转化及顺铂敏感性。进一步研究USP37对Hedgehog信号通路及Bcl-2/Bax的影响。　　方法:在乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中进行瞬时转染及慢病毒转染下调USP37。通过乳腺癌成球实验、划痕实验、Transwell及CCK-8等实验方法研究USP37蛋白对于乳腺癌细胞干性、凋亡、迁移、侵袭和顺铂敏感性的作用。通过免疫印迹实验，检测上皮间充质转化、干性相关指标和凋亡蛋白相关指标变化。相反，在乳腺癌细胞中瞬时转染技上调USP37表达。通过乳腺癌成球实验、划痕实验、Transwell及CCK-8实验方法研究USP37蛋白对于乳腺癌细胞干性、凋亡、迁移、侵袭和顺铂敏感性的作用。通过免疫印迹实验，检测上皮间充质转化、干性相关指标和凋亡蛋白相关指标变化。　　结果:下调USP37组的乳腺球数量及大小显著低于shScramble组。下调USP37可明显抑制干细胞标记物(ALDH1、OCT4)和Hedgehog信号通路（Smo、Gli-1）(P＜0.05)。细胞迁移实验及细胞侵袭实验结果显示下调USP37可降低乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力(P＜0.05)。经USP37 siRNA转染乳腺癌细胞处理48小时后，沉默USP37可明显降低Snail1，N-cadherin和Vemintin的蛋白表达水平，并且增加E-cadherin的蛋白表达水平。细胞免疫荧光趋势与western blotting结果一致。行CCK-8结果提示在1-32μg/ml顺铂浓度区间内，shUSP37#2组的细胞存活率显著低于shScramble组的细胞(P＜0.05)。　　结论:1.USP37下调可以抑制MCF-7和MDA-MB-231肿瘤球的形成能力、肿瘤干性相关蛋白（ALDH1、OCT-4）和Hedgehog信号通路蛋白（Smo和Gli-1）。说明下调USP37可以抑制乳腺癌细胞干性。2.过表达USP37可以促进MCF-7和MDA-MB-231肿瘤球的形成能力、肿瘤干性相关蛋白（ALDH1、OCT-4）和Hedgehog信号通路蛋白（Smo和Gli-1）。说明过表达USP37可以增强乳腺癌细胞干性。3.下调USP37可以抑制乳腺癌细胞上皮间质转化的能力，进而抑制细胞迁移及侵袭的能力。4.过表达USP37可以促进乳腺癌细胞上皮间质转化的能力、细胞迁移及侵袭的能力。5.下调USP37可以促进乳腺癌细胞凋亡，并且可以提高乳腺癌细胞对顺铂的敏感性;相反，过表达USP37可以降低乳腺癌细胞对于顺铂的敏感性。　　第三部分 体外实验探讨USP37对乳腺癌细胞干性的机制研究　　目的:探讨下调USP37是否通过Hedgehog信号通路调控乳腺癌细胞干性、上皮间质转化的能力。探讨USP37与Gli-1的相互作用以及USP37对Gli-1稳定作用。　　方法:通过免疫印迹检测Smo激活剂Purmorphamin(PM)对去泛素化酶USP37与Hedgehog信号通路的作用。通过Transwell实验、成球实验研究USP37是否通过Hedgehog信号通路调控乳腺癌细胞干性及上皮间质转化的能力。通过MG132实验、CHX实验及免疫共沉淀实验，研究USP37是否与Gli-1蛋白相结合并稳定其蛋白的活性。　　结果:在0.5μM PM处理24h及48h后，经免疫印迹实验检测USP37，Smo和Gli-1蛋白水平显著上调。免疫印迹实验结果示PM激活乳腺癌细胞的Hedgehog信号通路，促进乳腺癌细胞干性和上皮间质转化的能力。然而0.5μM PM48h后进行瞬时下调USP37，乳腺癌细胞Hedgehog信号通路、乳腺癌细胞干性和上皮间质转化的能力处于被抑制的状态。下调USP37可明显抑制PM诱导乳腺癌细胞侵袭及成球的能力。细胞免疫荧光结果示PM促进N-cadherin的蛋白表达，抑制E-cadherin的蛋白表达。　　结论:1.Purmorphamine可以激活Hedgehog信号通路，并上调USP37蛋白表达。说明USP37参与Hedgehog信号通路。提示Purmorphamine（Smo激动剂）正向调控USP37蛋白表达。2.Purmorphamine可以促进乳腺癌细胞MCF-7上皮间充质转化、肿瘤成球及细胞侵袭的能力。3.下调USP37可以逆转Purmorphamine诱导的乳腺癌细胞干性及上皮间质转化。提示USP37参与干扰Hedgehog信号通路对乳腺癌细胞生物学行为的调控。4.USP37与Gli-1相互作用。下调USP37对Gli-1的抑制作用是依赖于蛋白酶体降解的过程。下调USP37可降低Gli-1蛋白的稳定性:相反过表达USP37提高Gli-1蛋白的稳定性。提示USP37是调节Hedgehog信号通路下游Gli-1关键因子。　　第四部分 体内实验探讨下调USP37对乳腺癌MCF-7裸鼠种植瘤生长及顺铂敏感性的影响　　目的:探讨在体内环境中下调USP37对乳腺癌成瘤能力及对顺铂敏感性的影响。　　方法:细胞感染慢病毒载体shUSP37#2，筛选出稳定下调USP37的细胞株。将稳定下调USP37的乳腺癌细胞株接种于裸鼠体内，并观察裸鼠体内肿瘤生长情况，绘制肿瘤的生长曲线并测量肿瘤重量。同时向实验组裸鼠体内注射等剂量的顺铂，观察裸鼠体内形成肿瘤对于顺铂的敏感性。通过免疫印迹实验检测shUSP37#2和/或顺铂作用后Hedgehog/Bcl-2信号通路的变化。　　结果:shScramble组形成肿瘤的体积及重量显著高于shUSP37#2组的肿瘤(P＜0.05)。顺铂治疗组的肿瘤体积及重量明显低于shScramble组，提示顺铂治疗有效。shUSP37#2+顺铂治疗组的肿瘤体积及重量显著低于顺铂治疗组/shUSP37#2组的肿瘤(P＜0.05)。免疫组织化学检测USP37在shUSP37#2组的表达信号强度显著低于shScramble。Hedgehog信号通路中Gli-1和Smoothened在shUSP37#2+0.9％saline组的表达显著低于shScramble+0.9％saline组(P＜0.05);免疫印迹检测干性标记物ALDH1、OCT4在shUSP37#2+0.9％saline/DDP组的表达低于shScramble+0.9％saline/DDP组(P＜0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2在shUSP37#2+0.9％saline/DDP组的表达显著低于shScramble+0.9％saline/DDP组(P＜0.05)。经过蛋白定量分析发现，shUSP37#2+DDP组其Smoothened、Gli-1、ALDH1、OCT4、Bcl-2的蛋白表达量呈现最低的表达趋势(P＜0.05)。　　结论:、1.下调USP37抑制裸鼠体内乳腺癌MCF-7细胞成瘤的能力。2.下调USP37可以增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性，其机制是通过阻断Hedgehog/Bcl-2信号通路传导，抑制乳腺癌细胞干性及促进细胞凋亡。