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蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶(SnRK1)是植物中一种典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其在结构和功能上与酵母SNF1和哺乳动物AMPK有着较高的同源性,是植物调控碳氮代谢与生长发育的重要枢纽之一,但在果树中SnRK1的研究较少,其作用及调控的分子机理还不是很清楚。本课题组前期研究结果发现,超表达平邑甜茶MhSnRK1提高了番茄果实中可溶性糖含量,并能促进番茄果实的成熟,但其具体的作用机理尚不清楚。为了进一步认识SnRK1在果实发育过程中的调控作用,我们以毛桃品种‘瑞蟠17’(Prunus persica v ar‘Ruipan 17’)为试材,研究在果实发育过程中SnRK1蛋白激酶活性变化及其各亚基编码基因的表达水平,同时施加不同外源糖处理以及采取不同疏果处理,研究SnRK1蛋白激酶活性变化及其对不同糖信号的响应情况,进一步探讨其在糖代谢途径中的作用;由于桃转化体系尚未有效的建立,我们借助模式植物,以超表达桃PpSnRK1α的番茄纯合株系为试材,对SnRK1蛋白激酶调控果实成熟发育的作用机理进行研究。S nRK1蛋白激酶结构为三聚复合体,由催化亚基α及调节亚基β和γ组成,目前对调节亚基γ的功能研究报道较少,因此,我们克隆出了桃PpSnRK1γ1基因,并通过在模式植物拟南芥中异源表达,进一步分析其功能特性。具体研究结果如下:1.以‘瑞蟠17’桃果实为试材,测定了桃果实发育不同时期SnRK1蛋白激酶活性变化,并对其各亚基编码基因的表达进行了分析。发现桃SnRK1蛋白激酶在果实发育初期及两次快速生长期内酶活性较高,而在生长缓慢的硬核期时,酶活性维持在较低水平,这与其α催化亚基在转录水平上的基因表达较一致。2.通过外源海藻糖和山梨醇处理桃果实发现,SnRK1酶活性能响应两种外源糖信号的诱导。100 mM海藻糖处理桃果实后,果实中海藻糖-6-磷酸(T6P)的含量显著提高,桃SnRK1蛋白激酶的活性则显著降低,同时山梨醇脱氢酶(SDH)和蔗糖合酶(SS)合成方向酶活性也显著降低,而蔗糖磷酸合酶(SPS)的活性则显著升高。而在相同条件的山梨醇处理下,桃SnRK1酶活性则显著提高,SDH酶活相比于对照也显著提高,并且山梨醇处理后,桃果实中的果糖和蔗糖的含量明显升高,在两种不同的糖处理下,SnRK1蛋白激酶活性变化呈相反的趋势,但SDH的酶活性始终与SnRK1激酶活性呈一致的变化规律,推测两者间可能存在作用关系。3.通过酵母双杂交实验验证了桃SnRK1α与SDH和SPS蛋白之间存在互作关系,同时通过原核诱导蛋白表达,获得了桃SnRK1α与SDH的纯化蛋白,并通过SnRK1酶活测定方法初步验证了SnRK1与SDH之间的磷酸化作用,说明SnRK1可能在蛋白水平上,通过调节山梨醇脱氢酶SDH酶活性,参与山梨醇代谢途径的调控。4.超表达番茄株系OE-1、OE-3和OE-4中SnRK1酶活性在果实发育不同时期均显著高于野生型,完熟期果实中的淀粉及可溶性糖含量显著提高,而可溶性蛋白及可滴定酸的含量明显降低,同时发现超表达PpSnRK1α番茄植株的果实比野生型提早约10天成熟;酵母双杂交试验证明了PpSnRK1α和转录因子SIRIN蛋白间存在相互作用关系,并通过双分子荧光互补技术(BiFC)进一步验证了两蛋白在植物体内的相互作用发生在细胞核内。5.荧光定量结果显示,超表达番茄株系OE-1、OE-3和OE-4果实中RIN的表达量从果实转色期开始均显著高于野生型,且在粉红期时较野生型表达上调最显著。同时RIN下游成熟相关靶基因NOR、FUL1、ACS2、ACS4和E8的表达量也均不同程度的上调,转录因子NOR和FUL1编码基因在果实发育时期表达规律有所不同,NOR在转色期时表达量最高,而FUL1则在红熟期时表达水平最高。ACS2在红熟期时表达量最高,而ACS4则在转色期表达量最高。在果实发育不同时期,超表达PpSnRK1α番茄株系OE-1、OE-3和OE-4的果实中NOR和FUL1表达量以及ACS2,ACS4和E8的表达量均显著高于野生型WT,且成熟果实中乙烯的释放量与野生型相比也显著提高。6.根据桃基因组网站上已公布的基因信息,通过在线软件分析了桃SnRK1γ1亚基的分子量和等电点等信息,结果显示,PpSnRK1γ1亚基的分子量为46.8kDa,等电点为5.12,其亚细胞定位于细胞质中。同时又通过PlantCARE软件对其基因的启动子序列进行了顺式作用元件分析,探讨PpSnRK1γ1基因在转录水平的调节。选取PpSnRK1γ1基因的起始密码子前约2000bp左右序列进行分析,结果显示PpSnRK1γ1基因不仅可能响应温度胁迫和干旱胁迫等非生物胁迫的诱导,还可响应ABA和JA等激素的诱导。7.超表达PpSnRK1γ拟南芥T2代纯合株系A62、A63和A65的SnRK1酶活性均显著高于野生型植株WT,分别提高了12.9%、18.8%和10.4%。高温胁迫实验发现,37℃高温处理6小时后,过表达拟南芥株系的叶绿素含量显著高于野生型植株,其叶片黄化程度明显轻于野生型拟南芥植株,且超表达PpSnRK1γ1拟南芥株系A62、A63和A65叶片中的抗氧化酶类SOD和POD酶活性均显著高于野生型,而丙二醛MDA含量显著低于野生型WT,说明过表达PpSnRK1γ1可显著提高拟南芥植株对高温胁迫的耐受性。