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Wip1(Wild type p53-induced protein phosphatases,野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1)隶属于苏氨酸/丝氨酸PP2C蛋白家族,在脑胶质细胞瘤、乳腺癌、膜腺神经内分泌肿瘤等多种恶性肿瘤中均有异常表达,是一种新发现的原癌基因。研究表明Wip1基因的表达依赖于p53蛋白的活化,而其Wip1蛋白的过表达能使活化的p53蛋白去磷酸化和减少p53基因选择性突变,从而发挥其原癌基因功能。乳腺癌、脑胶质细胞瘤等恶性肿瘤中Wip1的异常表达能影响患者预后并提高肿瘤对抗癌药物的耐受性。但目前关于Wip1与宫颈癌的相关研究较少,特别在宫颈癌的辐射敏感性方面还未有报道。基于现状,本研究以Wip1为切入点,首次探讨Wip1对宫颈癌He La细胞生物学行为和辐射敏感性的影响,并阐明相关分子机制,以期为Wip1作为宫颈癌的放疗增敏靶点提供实验基础和理论支持,也为宫颈癌患者的个性化治疗提供新的治疗靶点。目的:阐述干预Wip1基因在增强宫颈癌细胞系He La细胞的辐射抗性过程中的作用及其机制,并探讨干预Wip1在宫颈癌治疗过程中的作用方法:(1)本研究采用的照射条件为:GC3000 Elan辐射器(MDS Nordion,加拿大),单次受照剂量2~3 Gyγ-射线。(2)应用Western bolt法检测不同宫颈癌细胞株中Wip1表达水平;(2)MTT法检测不同细胞株细胞增殖活性;(3)分别构建pc DNA3.1-Wip1和si RNA-Wip1重组质粒,将其转染入人宫颈癌细胞系He La细胞,构建空载体细胞、si Wip1细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞;(4)实时定量PCR法检测稳定转染细胞Wip1 m RNA表达量;(5)Western blot法检测稳定转染细胞Wip1蛋白表达量;(6)平板克隆形成实验检测He La细胞的放射敏感性;(7)流式细胞仪检测He La细胞凋亡水平;(8)彗星实验检测细胞在γ线照射后不同时间He La细胞的DNA片段分布,观察He La细胞的DNA损伤、修复情况;(9)Western blot法检测He La细胞p38,p-p38,p53和p-p53表达水平;(10)采用p38MAPK抑制剂SB203580预处理He La细胞,评价p38MAPK信号通路与He La辐射敏感性的关系;(11)应用Image J软件对蛋白电泳条带做灰度分析;(12)Student’s t-test用于分析数据,p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1、Wip1在不同放射敏感性宫颈癌细胞中的表达Wip1在不同宫颈癌细胞株表达不尽相同,其中He La细胞中Wip1表达水平最高,其次分别为Si Ha、C-33A、Me180;进一步比较这几种细胞在γ-射线辐射条件下的细胞增殖活性,He La细胞具有最强增殖活性,辐射抗性最强,其次分别为Si Ha、C-33A、Me180。2、Wip1表达沉默的He La细胞的构建设计Wip1基因及其si RNA,采用分子克隆技术构建pc DNA3.1-Wip1和si RNA-Wip1重组质粒,经酶切和测序鉴定证实。分别将pc DNA3.1空载体、si Wip1、si Wip1+pc DNA3.1-Wip1质粒转染He La细胞,构建空载体细胞、si Wip1细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞。转染48h之后,相对于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,si Wip1细胞Wip1 m RNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05),差距有统计学意义(P<0.05),空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞间没有明显差异(P>0.05)。3、沉默Wip1表达上调He La的辐射敏感性si Wip1细胞于转染后48 h起增殖速度显著降低并呈下降趋势,其72 h、96h细胞数目显著低于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,差距有统计学意义(P<0.05),空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞细胞数目在所有时间均没有显著差异(P>0.05);克隆形成数目和半径结果与之类似;细胞凋亡水平与之相反。联合γ-射线辐射时,si Wip1细胞克隆数目和克隆半径显著低于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,差距有统计学意义(P<0.05),正常细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞间没有明显差异(P>0.05);细胞凋亡水平与之相反。4、沉默Wip1表达下调辐射条件下He La细胞的DNA损伤修复与空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞相比,si Wip1细胞DNA损伤程度较重,表现在彗星头部DNA百分比明显减少,而彗星尾部的小片段破损DNA百分比明显升高,差距有统计学意义(P<0.05),空载体细胞与si Wip1+过表达Wip1细胞间没有明显差别(P>0.05)。5、Wip1与p38MAPK信号通路中蛋白表达相对于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,si Wip1细胞p-p38、p53和p-p53的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.05),正常细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞间没有明显差异(P>0.05)。而三组细胞中p38表达水平没有显著差别(P>0.05)。当预处理SB203580时,si Wip1+SB20358细胞相对于si Wip1细胞p-p38、p53和p-p53的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.05),而与空载体细胞p-p38、p53和p-p53的表达水平相近(P>0.05),三组细胞p38水平没有显著差别(P>0.05)。6、SB203580逆转Wip1提高了细胞的辐射敏感性当预处理SB203580时,si Wip1+SB203580细胞和空载体细胞的克隆数目、克隆半径和凋亡水平相近,差异没有统计学意义(P>0.05);当联合γ-射线辐射时,si Wip1+SB203580细胞和空载体细胞的克隆数目、克隆半径和凋亡水平同样相近(P>0.05),表明SB203580逆转沉默Wip1能提高细胞的辐射敏感性。结论:1.Wip1在宫颈癌He La细胞的放疗敏感性中发挥重要的调节作用,沉默Wip1表达可以使γ-射线辐射后He La细胞细胞增殖、克隆形成和抗凋亡能力降低;2.Wip1能增强γ-射线辐射所引起的He La细胞DNA损伤的修复,从而增强其放疗耐受性;3.Wip1的基因沉默可通过激活p38MAPK信号通路参与宫颈癌He La细胞辐射耐受性的形成,作用位点在于上调p53表达和P38磷酸化;综上所述,本研究丰富了Wip1-肿瘤辐射敏感性网络,发现了Wip1对He La细胞辐射敏感性及p38MAPK信号通路的调控作用;以Wip1为治疗靶点,联合辐射诱导技术对宫颈癌治疗的实验尝试,可为其的放射治疗提供新的理论和实践视角,为肿瘤基因-放射治疗应用临床提供理论支持。但Wip1对辐射敏感敏感性的调控机制,尤其是调控通路间的协同机制和辐射敏感性的动物实验仍需更多的工作进一步的研究。