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研究背景微囊泡（Microvesicles,MV）是细胞释放的直径100-1000 nm的脂质双分子膜性囊泡,它们选择性地包装源细胞的多种生物活性物质,如脂质、细胞因子、趋化因子、生长因子、特异性及非特异性蛋白、DNA、m RNA、microRNA、lnc RNA、circ RNA等[1],介导细胞间信号的传递。近来研究表明,囊胚能够分泌微囊泡且作用于受体细胞,改变受体细胞功能和行为[2]。在哺乳动物中,妊娠的建立需要通过胚胎发出怀孕识别信号,然后胚胎植入和胎盘形成[3]。胚胎植入是囊胚与母体子宫内膜相互“对话”的结果,囊胚在原癌基因、粘附分子等的调控下有序侵袭母体子宫内膜,在此过程中,子宫内膜在各种细胞因子、雌激素、孕激素和粘附因子组成的网络系统的精确调控下,产生对胚胎的容受性[4]。在此期间,子宫内膜上皮细胞发生了明显的形态和结构变化,以适应胚胎的着床。其主要特征是上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）,即上皮细胞首先失去极性和细胞间黏附,然后获得侵袭和迁移能力,最终转化为间充质表型[4]。细胞间的交流传统上认为是通过直接细胞间接触或通过细胞分泌的信号分子传递信息进行。近来研究显示,MV在细胞间转移也是一种重要细胞通讯方式[5],且微囊泡的信使功能主要依赖来源细胞的表型[6]。因此,我们推测,囊胚微囊泡参与囊胚与子宫内膜细胞对话,且与子宫内膜上皮-间质转化可能存在一定联系。因此,本课题采用孕3.5天BABL/C小鼠囊胚和子宫内膜原代细胞为材料,建立囊胚微囊泡与子宫内膜上皮细胞的共培养体系,分析植入前囊胚MV对子宫内膜上皮细胞上皮-间质转化的影响。验证囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞向间质细胞转化的可能性,为胚胎植入过程中MV通讯提供依据。研究目的1.建立一种小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.验证小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮-间质转化的现象和可能机制。研究方法1.用不同的酶和不同纯化方法处理子宫内膜组织得到子宫内膜上皮细胞,用形态学观察、细胞免疫荧光法和流式细胞术鉴定子宫内膜上皮细胞特征性蛋白Cytokeratin-8的表达,以检测细胞纯度,建立一种小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.取孕3.5天BABL/C孕鼠子宫,收集囊胚,经超高速离心结合密度梯度离心分离纯化MV,透射电子显微镜观察其形态,纳米颗粒跟踪仪测定其尺寸分布,WB分析其特征性蛋白Tsg101与CD63的表达。建立囊胚MV与子宫内膜上皮细胞（mEEC）共培养模型,ECIS实时监测120 h内子宫内膜上皮细胞侵袭力的动态变化。取12 h、36 h、48 h、60 h、84 h、120 h作为时间节点,将植入前囊胚MV与mEE细胞共培养组与mEE细胞对照组的电阻值进行比较分析。q PCR分析MV miRNA组成,通过对这些miRNA及其靶基因的生物信息学分析,预测了可能对受体细胞侵袭有促进作用的miRNA和和诱导EMT的可能机制。3.以PKH26对囊胚MV染色示踪,建立植入前囊胚MV与mEE细胞的共培养体系,分别设置0 h、48 h、96 h组别。采用激光共聚焦显微镜检测植入前囊胚MV进入mEE细胞的过程。通过Western-blot实验和细胞免疫组化实验检测mEE细胞对E-cadherin、Vimentin蛋白的表达。并采用Image J软件进行细胞表达E-cadherin、Vimentin蛋白相对量化分析。研究结果1.两种方法中,上皮细胞分离后成团,贴壁较慢,将5×10~5个细胞接种于24孔板中,24 h后,细胞可长至80%爬片,使用胰蛋白酶消化均不可传代培养。形态学及上皮细胞特异性抗体Cytokeratin-8鉴定为上皮细胞。流式细胞仪鉴定Dispase Ⅱ与胰酶消化后差速贴壁纯化（方法A）所提上皮细胞纯度为80%,胶原酶I与DNase消化后过筛纯化（方法B）所提上皮细胞纯度为60%,方法A可简单、高效地培养出原代上皮细胞,且具备上皮细胞生物学特性,是一种良好的小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的方法。2.孕3.5天囊胚处理后通过超高速离心结合密度梯度离心分离出一种直径主要约在200 nm的球形微囊泡,并表达微囊泡特征蛋白Tsg101和CD63。ECIS结果显示mEE细胞与小鼠囊胚MV共培养至12 h、24 h、36 h其侵袭力与mEE细胞对照组相比较无明显差异（P>0.05）,当培养至48 h、60 h时,实验组mEE细胞的侵袭力明显高于对照组细胞（P<0.05）,当培养至84 h、120 h时,实验组mEE细胞的侵袭力极显著高于对照组细胞（P<0.01）。PCR结果显示植入前囊胚MV中有224个与侵袭相关的miRNA,占总侵袭相关miRNA的近一半,80个miRNA可以促进侵袭。尽管抑制侵袭的miRNA在数量上占优势,但一些促进侵袭的miRNA在MV中已经有了高水平的表达,如miR-346、miR-21。提示小鼠囊胚MV诱导上皮细胞EMT可能是MV携带miRNA-21靶向PTEN激活PI3K/AKT通路调控的。3.植入前囊胚MV与mEE细胞共培养0 h,mEE细胞内没有PKH26标记的MV,共培养96 h,有大量的MV聚集在mEE细胞的胞质内及细胞核周边。且相比于共培养0 h,共培养96 h的mEE细胞对PKH26标记的MV的摄取率显著升高（P<0.01）。与此同时,E-caderhin蛋白在mEE细胞中表达显著下调（P<0.05,P<0.01）,Vimentin蛋白在mEE细胞中表达显著上调（P<0.05,P<0.01）。结论1.采用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶共同消化子宫组织再经差速贴壁纯化获得子宫内膜上皮细胞原代的培养方法可简单、高效地培养出原代上皮细胞,是一种良好的小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.植入前囊胚MV与mEE细胞共培养体系确定了植入前囊胚MV是能够促进mEE细胞侵袭能力的,且能够影响mEE细胞E-caderhin蛋白、Vimentin蛋白的表达。基于小鼠囊胚MV含有的miRNA种类以及特性,此结果提示mEE细胞侵袭性增强进而向间质细胞转化的可能性是与小鼠囊胚携带着miRNA-21靶向PTEN激活PI3K/AKT通路调控的。