目的 糖尿病血管病变是糖尿病慢性并发症的主要表现，其发生与一些生长因子及血管活性因子密切相关，其发生机制十分复杂，过去对高糖诱导的蛋白质非酶糖基化、多元醇通路异常，二酰基甘油—蛋白激酶C(PKC)通路研究较多，随着分子生物学及其技术的发展，有关细胞信号转导的研究成为最活跃的领域之一。丝裂原激活的蛋白激酶P38(P38MAPK)激活可能成为参于糖尿病血管并发症发生发展的重要因素。同时，近年来的研究表明，核转录因子(NF-κB)在糖尿病及其并发症发生发展中起重要作用。本实验观察了糖尿病大鼠肺组织及其微血管的组织病理学改变；观察了Ⅳ型胶原酶(MMP2、MMP9)及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达及细胞信号转导系统重要酶类—PKC、P38MAPK，NF-κB活性的变化，为‘糖尿病肺’研究提供实验依据。 方法 1．动物分组及模型制备：150-170g雄性SD大鼠36只，单笼饲养，随机分为正常对照组(18只)、DM组(18只)。DM组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)60mg／kg，2天后血糖≥16.7mmol／L的为DM大鼠，正常对照组注射等量生理盐水，各组动物饲养1个月。部分动物处死后速取肺脏，左肺取小组织块迅速送入冰箱(-70℃)备测生化指标及1mm直径组织块2.5％戊二醛固定。另一部分动物经4％多聚甲醛灌注后取肺组织，用4%多聚甲醛/0 .1%的DEPC溶液固定，48一72h后逐级脱水，常温石蜡包埋，备做免疫组化染色及原位杂交。 2.特殊染色及HE常规染色及透射电镜观察 网状纤维染色采用Gomori渡银染色方法 胶原纤维染色采用weigert·5 resorein一fuehsin染色法 3.肺组织PKC活性的测定 PKC活性的测定采用改良的Takay法。肺组织溶于粉碎缓冲液，超声粉碎(50次/管)，取上清加ATP反应液，30OC保温8分钟，取25 pL点在what一manP81强阳离子交换滤纸上，加入75mmol/L磷酸溶液终止反应，反复洗三次后晾干，放入预装有sml闪烁液的液闪瓶中，液体闪烁仪(美国Beckmanlsol型)测定cpm数。 4.免疫组化方法检测MMPZ、MMPg、NF一B、TGF一pl 免疫组化染色一抗为免抗鼠NF一KB、MMPZ、MMpg、TGF一pl，抗体工作浓度为1:100。二抗为羊抗兔，按SABC免疫组化试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木素复染。梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，细胞胞浆，胞膜出现棕黄色或黄色者为阳性细胞。每组随机选10只大鼠组织切片，采用图像分析软件(Luzex型图像分析仪)随机取高倍视野(含小支气管)，筛选棕黄色颗粒细胞，镜下计数阳性细胞数，测定平均灰度值。 5.P38MAPK检测 原位杂交检测P38MAPK操作按检测试剂盒说明书进行。采用ATPP3 8 MAPK的寡核普酸探针，经地高辛标记，针对大鼠P38 MAPK的寡核昔酸探针序列为5’一GTGTG CCGAG CCAGT CCAAA ATCCA GAATC一3，，P38MAPK mRNA的颗粒在细胞浆着色呈棕黄色。每组随机选6只大鼠组织切片，采用图像分析软件(Luzex型图像分析仪)随机取高倍视野(含小血管)筛选棕黄色颗粒细胞，镜下计数阳性细胞数，测定mRNA的相对含量。 6.蛋白质免疫印迹分析NF一KB，TGF一pl水平 按蛋白质从SDS聚丙烯酞胺凝胶转移至固相支持体的免疫学测定方法进行(1)。取正常及实验组肺组织提取蛋白，用SDS聚丙烯酞胺电泳(SDS一队GE)分离，转移至固相支持体—硝酸纤维滤膜上，分别按程序加入NF一KB、TGF一pl一抗及二抗，滴加发光剂，摄X光片。应用ehenxmage:5500 vZ.o3分析软件对Westem带灰度值进行分析。 7.统计学处理方法 实验数据处理结果以均值士标准差表示。数据分析采用统计程序软件包(sPsslo.sforwindows)进行方差分析，应用student’st检验来判断差异的统计学意义，p值小于0.05差异具有显著性。结果 1.肺组织病理学变化。 DM大鼠肺组织成纤维细胞数量增加，肺泡间隔及毛细血管基底膜增厚，胶原纤维在肺泡间隔、细支气管、小血管及肺泡上皮细胞胞浆内明显增多，互相交织，着色较深，染成红色。 2，免疫组化结果 2.1 TGF一pl染色结果 正常组大鼠的气管粘膜上皮细胞、肺泡巨噬细胞及少数血管内皮细胞可见弱的TGF一pl表达。TGF一Bl在DM大鼠肺组织表达明显增多，表现在支气管粘膜上皮细胞，微血管内皮细胞、少量肺泡上皮细胞及一些肺间质细胞，可见胞浆棕黄色颗粒。 2.2 MMPZ、MMPg染色结果 MMPZ及MMpg在正常组大鼠肺组织的支气管粘膜上皮细胞，肺泡巨噬细胞及小血管内皮细胞均有表达，在DM组大鼠上述部位表达不同程度减弱，以MMPg更为明显。 2.3 NF一KB染色结果 正常组大鼠气道上皮细胞、肺泡上皮细胞，间质细胞及少数血管内皮细胞可见弱的NF一KB表达。DM大鼠NF一KB在肺组织上述部位表达明显增多，表现在可见较多的胞核及胞浆棕黄色颗粒。 3.P38MAPKmRNA原位杂交结果 DM大鼠P38MAPK」11朋A主要存在于血管内皮细胞，定位于胞浆，呈棕黄色颗粒，支气管粘膜上皮及少量间质细胞可见轻度表达。正常组大鼠肺组织内仅偶见间质细胞胞浆着色，染色较浅。 4.同位